蛋白质的理化性质与分离纯化讲义

1、蛋白质的理化性质及分离纯化第一节 蛋白质的理化性质第二节 蛋白质的分离纯化第三节 蛋白质的分子量测定第四节 蛋白质的含量测定与纯度鉴定第一节 蛋白质的理化性质一、蛋白质的酸碱性质二、蛋白质的紫外吸收性质四、蛋白质的变性和复性五、蛋白质的呈色反应三、蛋白质的胶体性质和沉淀一、蛋白质的酸碱性质 蛋白质由氨基酸组成,且保留着游离的末端-氨基和-羧基以及侧链上的各种功能团。因此有些理化性质与氨基酸相同。 蛋白质也是一类两性电解质,能和酸或碱发生作用。 可解离基团主要来自侧链上的功能团。 如果是缀合蛋白质,则还有辅基成分所包含的可解离基团。一、蛋白质的酸碱性质在某pH时蛋白质所带正电荷与负电荷恰好相等，

2、即蛋白质的净电荷为零时的pH称等电点（pI）。没有其他盐类干扰时, 蛋白质质子供体基团解离出来的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的pH称为等离子点。蛋白质等电点：蛋白质等离子点：二、蛋白质的紫外吸收性质蛋白质溶液能吸收一定波长的紫外光，主要是由带芳香环的氨基酸决定的。其在280nm处对紫外吸收能力的强弱顺序为：色（ Trp ） 酪（ Tyr ） 苯丙（ Phe ）三、蛋白质的胶体性质和沉淀 蛋白质的分子大小属于胶体质点的范围。蛋白质溶液是一种稳定的亲水胶体（具有水化层和双电子层）。 蛋白质溶液具有胶体的一般性质：布朗运动、丁达尔效应以及不能通过半透膜。 半透膜：多是由用赛咯吩（cello

3、phane）制造，赛咯吩膜是半通透的膜，蛋白质等大分子不能透过膜，但小分子可以透过。（一）蛋白质的胶体性质（二）蛋白质的沉淀 蛋白质在溶液中的稳定性是有条件的、相对的。如果条件发生改变,破坏了蛋白质的稳定性,蛋白质就会从溶液中沉淀出来。蛋白质溶液的稳定性与质点大小、电荷和水化作用有关,那么任何影响这些条件的因素都会影响蛋白质的稳定性。 沉淀蛋白质的方法有以下几种:中性盐沉淀法、有机溶剂沉淀法、重金属盐沉淀法、生物碱试剂和某些酸类沉淀法、加热变性沉淀法.盐析：向蛋白质溶液中加入大量的中性盐(如：硫酸铵,硫酸钠或氯化钠等),使蛋白质表面的电荷被中和，蛋白质分子脱去水化层而聚集沉淀。1.中性盐沉淀法

4、（盐析法）注意：盐析一般不引起蛋白质变性。当除去盐后,蛋白质又可溶解。 2.有机溶剂沉淀法 向蛋白质溶液中加入一定量的极性有机溶剂(如甲醇,乙醇或丙酮等) 引起蛋白质脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用，致使蛋白质颗粒容易凝聚而沉淀。3.重金属盐沉淀法当溶液pH大于等电点（pI）时,蛋白质颗粒带负电荷，这样它就容易与重金属离子(Hg2+,Pb2+,Cu2+,Ag+等)结合成不溶性盐而沉淀。应用 ：误服重金属盐的病人可口服大量牛乳或豆浆等蛋白质进行解救,然后再服用催吐剂排出体外。4.生物碱试剂和某些酸类沉淀法生物碱试剂是指能引起生物碱沉淀的一类试剂：如：鞣酸（单宁酸,tannic

5、 acid) 钨酸(tungstic acid，H2WO4)、苦味酸(picric acid)即2,4,6-三硝基酚, 碘化钾等。某些酸类:三氯醋酸, 磺基水杨酸（sulfosalicylic acid）和硝酸等. 当 pH pI，蛋白质带正电荷与生物碱试剂某些酸根负离子 不溶性沉淀反应5.加热变性沉淀法几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。当蛋白质处于等电点时,加热凝固最完全和最迅速。加热变性引起蛋白质凝固的原因：可能是由于热变性使蛋白质天然结构解体，疏水基外露，因而破坏了水化层，同时由于蛋白质处于等电点也破坏了带电状态。 蛋白质沉淀的应用（制作豆腐）制作方法： 将大豆或豆饼加水浸泡后磨浆，过

6、滤，加水煮沸，再加蛋白沉淀剂(盐卤或石膏)使蛋白质凝固沉淀，然后加压去水而成。 四、蛋白质的变性和复性蛋白质变性的定义： 环境的变化或是化学处理都会引起蛋白质天然构象的破坏，并伴随着生物活性的丧失、溶解度的降低以及其它理化常数的改变，这一过程称为蛋白质变性。蛋白质的复性：蛋白质的复性当变性因素除去后，变性蛋白质又重新回复到天然构象的现象成为蛋白质的复性。蛋白质变性后的特性： 生物活性丧失、侧链基团暴露、理化性质改变、生化性质改变茚三酮反应（ninhydrin reaction)： 蛋白质经水解后产生的氨基酸也可以与茚三酮发生反应呈现蓝色。双缩脲反应(biuret reaction)： 蛋白质和

7、多肽分子中的肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或者粉红色，此反应称为双缩脲反应。双缩脲反应可以用来检测蛋白质的水解程度。五、蛋白质的呈色反应蛋白质的呈色反应反应名称试 剂颜色反应有关基团双缩脲反应NaOH、CuSO2紫色或粉红色二个以上肽键酚试剂反应碱性CuSO4及磷钨酸-钼酸蓝色酚基、吲哚基茚三酮反应茚三酮蓝色自由氨基及羧基蛋白质的理化性质一、蛋白质的酸碱性质二、蛋白质的紫外吸收性质四、蛋白质的变性和复性五、蛋白质的呈色反应三、蛋白质的胶体性质和沉淀第二节 蛋白质的分离纯化 蛋白质在组织和细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都会含上千种不同的蛋白质。为什么要分离纯化蛋白质

8、？1.研究蛋白质的分子结构、组成和某些物化性质。2.研究活性蛋白质的生物学功能，要求样品保持它的天然构象，要尽量避免因变性而丢失活性。3.在制药工业中，需要把某种具有特殊功能的蛋白质纯化到规定的要求，特别注意把一些具有干扰或拮抗性质的成分除去。 到目前为止，还没有一个单独的或一套现成的方法把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中纯化出来。 但对任何一种蛋白质都可能选择一套适当的分离纯化程序以获得高纯度的制品。 一、蛋白质分离纯化的一般步骤1.蛋白质样品的前处理 2.蛋白质粗提液的粗分级分离3.浓缩蛋白质的细分级分离4. 蛋白质的结晶一、蛋白质分离纯化的一般步骤(1) 去除杂质： a.动物材料：先剔

9、除结缔组织和脂肪组织。 b.种子材料：先去壳去种皮以免受单宁等物质污染。 c.油料种子：先用低沸点的有机溶剂如乙醚等脱脂。1.蛋白质样品的前处理 (2) 细胞破碎：选择适当的方法,将组织和细胞破碎。 a.动物材料：电动捣碎机、匀浆机或用超声波处理。 b.植物材料：与石英砂或玻璃粉研磨、用纤维素酶处理。 c.细菌：与砂研磨,高压挤出或溶菌酶处理等。(1) 去除杂质。(2) 细胞破碎。(3)溶提：选择适当的缓冲液把所要的蛋白质提取出来。 a.如果所要的蛋白质主要集中在某一细胞组分, 可利用差速离心分离。 b.如果所要纯化蛋白质与细胞膜或膜质细胞器结合,则用超声波或去污剂使膜结构解聚，然后用适当介质

10、提取。生物组织的破碎 溶解 离心 蛋白的粗提取液1.蛋白质样品的前处理 2.蛋白质粗提液的粗分级分离大量粗提液超过滤、凝胶过滤冷冻真空干燥或其他方法(PEG) 浓缩蛋白质少量蛋白质粗提液盐析等电点沉淀有机溶剂分级稀释法浓缩蛋白质3.浓缩蛋白质的细分级分离主要方法：凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析、亲和层析等。辅助方法：电泳法（包括区带电泳,等电聚焦等）得到蛋白的精制品4. 蛋白质的结晶 结晶是蛋白质分离纯化的最后步骤。尽管结晶并不能保证蛋白质一定是均一的,但只有某种蛋白质在溶液中数量上占优势时才能形成结晶。重结晶又可除去少量夹杂的蛋白质。 蛋白质的结晶不仅是纯度的一个标志,也是断定制品处于天然

11、状态的有力指标。只有获得蛋白质晶体才能对它进行X射线结构分析。 一、蛋白质分离纯化的一般步骤1.蛋白质样品的前处理 2.蛋白质粗提液的粗分级分离3.浓缩蛋白质的细分级分离4. 蛋白质的结晶二、蛋白质的分离纯化方法主要是根据蛋白质在溶液中的性质不同对蛋白质进行分离。分子大小溶解度电荷吸附性质对配体分子的生物学亲和力（一）根据蛋白质分子大小不同的纯化方法主要方法：1：透析（dialysis）和超过滤（ultrafiltration）2：密度梯度（区带）离心3：凝胶过滤法1：透析和超过滤（利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质） 将浓缩液装在一个用半透膜的透析袋内，两端都密封好，然后将透析袋悬浮在一个装

12、有缓冲液的容器内进行透析。由于透析袋内溶液浓度高而袋外浓度低，因此，透析袋内外将进行物质交换，袋内溶质向袋外渗透，趋向浓度平衡。透析流程透析装置 蛋白质等大分子不能透过半透膜，仍然留在袋内。 但蛋白质周围的小分子可以与缓冲液进行交换。 通过多次更换透析液，就可除去小分子。透析流程超过滤装置 使用压力或者离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜（半透膜），达到浓缩蛋白质溶液的目的。2：密度梯度（区带）离心 蛋白质颗粒的沉降不仅决定于它的大小,而且也取决于它的密度。 如果蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质（常用蔗糖梯度）中离心时,质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快,并且每种蛋白质颗粒

13、沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时,即停止不前,最后各种蛋白质在离心管中被分离成各自独立的区带(zone)。装好具备密度梯度的介质溶液密度梯度（区带）离心流程图离心收集分离后的各组分加入：混和蛋白质样品离心装置3：凝胶过滤法 凝胶过滤是按照蛋白质分子大小进行分离的技术，又称凝胶层析、分子筛层析或排阻层析。 凝胶过滤法是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。（1）凝胶过滤的介质 凝胶过滤所用的介质是装在凝胶柱里的凝胶珠（或称凝胶颗粒、凝胶球）。其内部是多孔的网状结构，单个凝胶珠本身象个“筛子”。不同类型凝胶的筛孔的大小不同 。凝胶柱 Sephadex 交联葡聚糖 Bio-gel P 聚

14、丙烯酰胺凝胶 Sepharose或Bio-gel A 琼脂糖凝胶（）凝胶介质颗粒的选择 凝胶的交联度或孔度（网孔大小）决定了凝胶的分级分离范围，即能被该凝胶分离开来的蛋白质混合物的相对分子质量范围进行凝胶过滤。凝胶过滤所用的凝胶孔径大小的选择主要取决于要纯化的蛋白质分子量。（）凝胶过滤的原理： 当含有大小不同的蛋白质样品加到凝胶柱上时，比凝胶珠平均孔径小的蛋白质就可以穿入珠子的内部。 这样在洗脱时，小分子不但其运动路程长，而且受到来自凝胶珠内部的阻力也很大，所以越小的蛋白质，把它们从柱子上洗脱下来所花费的时间越长。凝胶中只有很少的孔径可接受大的蛋白。因此，大的蛋白质直接通过凝胶珠之间的缝隙首先

15、被洗脱下来。凝胶过滤分离蛋白质的流程开始洗脱后，大分子由于受到的阻力小而先被洗脱出来洗脱收集上样样品上柱后，样品中的小分子可以进入凝胶微孔，但是大分子不能进入。这样大小不同的蛋白质就被分离开来了。 依次洗脱收集后，通过紫外吸收法测定吸收峰。（一）根据蛋白质分子大小不同的纯化方法主要方法：1：透析（dialysis）和超过滤（ultrafiltration）2：密度梯度（区带）离心3：凝胶过滤法（二）根据蛋白质溶解度不同的纯化方法（蛋白质的胶体和沉淀性质） 主要方法：1：等电点沉淀和PH值控制2：蛋白质的盐溶和盐析3：有机溶剂分级分离法4：改变温度1.等电点沉淀和PH值控制 蛋白质是两性电解质，

16、在不同的PH条件下，蛋白质分子的电荷性质和数量会发生变化，当pH = pI，净电荷为零，相邻蛋白质分子之间失去了静电斥力而趋向于聚集沉淀。即在不改变其它条件的情况下，PH处于等电点时的蛋白质溶解度达到最低点。而位于等电点两侧的PH条件下蛋白质的溶解度迅速上升。1.等电点沉淀和PH值控制 由于不同的蛋白质等电点不同，因此可以通过控制溶液的PH值来沉淀混合物中的某种蛋白成分。 通过这种办法沉淀出来的蛋白质可以保持天然构象，能重新溶解于一定浓度的溶液中。2.蛋白质的盐溶和盐析盐溶（salting-in） ：低浓度的中性盐可以增加蛋白质的溶解度，这种现象称为蛋白质的盐溶现象。盐溶的形成原因：盐溶作用主

17、要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间的相互作用却加强，因而溶解度增高。同浓度二价中性盐对蛋白质溶解度的影响比单价中性盐大的多。盐析（salting-out） ：当溶液中的离子强度达到一定的数值时（盐浓度高达一定数值时），蛋白质的溶解度开始下降，很多蛋白质可以从水溶液中析出，这种现象称为盐析。盐析的形成原因：大量中性盐的加入使得水的活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水，蛋白质表面的疏水基团暴露并由于疏水作用而聚集沉淀。 盐析法是分离纯化蛋白质的过程中最常用的方法之一，盐析出的蛋白质仍然保持蛋白的天然构象。3.有机溶剂

18、分级分离法 与水互溶的有机溶剂（如甲醇、乙醇和丙酮等） 能使蛋白质在水中的溶解度显著降低，在室温下，这些有机溶剂不仅能引起蛋白质沉淀，而且伴随着变性。这种沉淀的主要原因是有机溶剂的加入改变了介质的介电常数。4.改变温度分离蛋白质040oC之间：大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而增加， 例外：025oC，人的血红蛋白溶解度随温度上升而降低。4050oC以上，大部分蛋白质变得不稳定并开始变性。一般蛋白质的分级分离操作一般都在04oC温度下进行。（二）根据蛋白质溶解度不同的纯化方法（蛋白质的胶体和沉淀性质） 主要方法：1：等电点沉淀和PH值控制2：蛋白质的盐溶和盐析3：有机溶剂分级分离法4：改变温

19、度（三）根据蛋白质电荷不同的纯化方法主要方法： 电泳 离子交换层析电泳概述 电泳：在外电场的作用下，带电颗粒，例如不处于等电状态的蛋白质分子，将向着其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳(electrophoresis)。电泳的方向与速度与下列因素有关：电荷的正负性电荷的多少颗粒的大小与形状。电泳概述由于蛋白质在指定的PH溶液中所带电荷和分子量不同，形状不同，在电场中泳动速度不同。因此根据这一原理就可以从蛋白质混合液中将各种蛋白质分离开来，所以电泳技术已成为分析、分离蛋白质的重要手段之一。电泳分类区带电泳：电泳过程中，不同的离子成分在均一的缓冲液体系中分离成独立的区带，这是当前应用最广泛的电泳

20、技术。移界电泳：是Tiselius最早建立的电泳，它是在U型管中进行的，由于分离效果较差，已为其他电泳技术所取代。等速电泳：需专用电泳仪，当电泳达到平衡后，各区带随分成清晰的界面，并以等速移动。等电聚焦电泳：由于具有不同等电点的两性电解质载体在电场中自动形成pH梯度，使被分离物移动至各自等电点的pH处聚集成很窄的区带，且分辨率较高。从表面看与区带电泳相似，但原理不同。按分离原理分类按有无支持物分类：类别名称有支持物电泳纸上电泳醋酸纤维薄膜电泳薄层电泳非凝胶性支持物区带电泳（支持物有：淀粉，纤维素粉，玻璃粉，硅胶等）凝胶支持物区带电泳（淀粉凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶）自由电泳Tiseliu

21、s或微量电泳显微电泳等电点聚焦电泳等速电泳密度梯度电泳应用于蛋白质分离纯化中的电泳目前电泳的类型很多，但是它们都是在经典的自由电泳或称为移动界面电泳的基础上发展起来的如图：先在U型管内使蛋白质溶液和缓冲溶液之间形成清晰的界面，然后加一外电场。由于界面处存在浓度梯度因而产生折射率梯度，利用适当的光学系统（见沉降速度法）可以观察到界面的移动。在电泳过程中，每个移动界面（峰）相当于某一特定的蛋白质。区带电泳： 在支持物上电泳蛋白质混合物,将其分离成若干区带根据支持物的不同滤纸电泳和薄膜电泳粉末电泳：支持介质是淀粉、纤维素粉或硅胶粉细丝电泳：尼龙丝和其他人造丝电泳 微量电泳凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶：适用

22、于分离蛋白质琼脂糖凝胶：适于分离核酸。醋酸纤维薄膜电泳等1.聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylaminde gel electrophoresis) PAGE电泳 它以聚丙烯酰胺凝胶为支持物，一般制成凝胶柱或凝胶板（不连续体系）。凝胶的浓度（孔径大小）、缓冲液组分和离子强度、pH以及电场强度都是不同的浓缩胶分离胶样品浓缩成很薄的起始区带（0.1mm）分离成单区带聚丙烯酰胺凝胶电泳的优点： 聚丙烯酰胺化学性能稳定。 聚丙烯酰胺在一定浓度范围内凝胶无色透明，有弹性，易观察，可用检测仪直接测定。 聚丙烯酰胺凝胶孔径可调，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径

23、大小。 分辨率高，尤其在不连续不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体，有更高的分辨率。 PAGE应用广泛，可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性、定量及少量的制备，还可测定分子量、等电点等。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS) SDS:是用SDS（十二烷基硫酸钠）和还原剂（通常为巯基乙醇）先对待分离的蛋白质样品进行预处理（加热煮沸35分钟）。 通过加热和SDS可以使蛋白质变性：多亚基的蛋白质解离为单亚基。二硫键被切断。 SDS是带有负电荷的分子，所有结合SDS的蛋白质的形状近似于长的椭圆棒，全部带上了大量的负电荷。 电泳时SDS-蛋白质复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白质原有电荷

24、和形状的影响（全部由负极向正极移动），而主要取决于蛋白质分子量。 浓缩胶分离胶样品SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳装置点样浓缩胶分离胶样品SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳装置电泳结果每条带代表不同分子量的蛋白质或者肽段，这样蛋白质就分离开了2.毛细管电泳 泛指高效毛细管电泳、毛细管区带电泳、自由溶液毛细管电泳和毛细管电泳。 用途：分离多种生物分子，包括氨基酸、肽、蛋白质、DNA片段（例如合成的寡核苷酸）和核酸以及多种小分子，如药物、甚至金属离子。用样量530l 1mg/ml溶液。3.等电聚焦电泳等电聚焦或称电聚焦，是一种高分辨率的蛋白质分离技术，它也可用于蛋白质等电点的测定。蛋白质混合物是在具有pH梯度的

25、介质（如浓蔗糖溶液）中进行电泳的。在外电场作用下各种蛋白质将移向并聚焦（停留）在等于其等电点的pH梯度处，并形成一个很窄的区带。等电聚焦可以把人的血清分成40多个条带。此技术特别适用于同功酶的鉴定。只要它们的pI有0.02（甚至0.02）pH单位的差别就能分开。 实际上是利用缓冲液在电场作用下在凝胶内沿电场方向制造一个pH梯度。所用的缓冲液是低分子量的有机酸和碱的混合物，该混合物称之两性电解质。等电聚焦电泳装置 当蛋白质样品在这样的凝胶上电泳时，每种蛋白质都将迁移至与它的pI 相一致的pH处，具有不同pI的各种蛋白质最后都迁移至凝胶中相应的pH处，达到分离的目的。4.蛋白质的双向电泳（two-

26、dimensional electrophoresis） 将等电聚焦电泳与SDS结合起来的电泳技术。电泳方向电泳方向等电聚焦电泳SDS 双向电泳后的凝胶经染色蛋白呈现二维分布图，水平方向反映出蛋白在pI上的差异，而垂直方向反映出它们在分子量上的差别。 所以双向电泳可以将分子量相同而等电点不同的蛋白质以及等电点相同而分子量不同的蛋白质分开。是根据蛋白质的等电点差异分离蛋白质混合物的柱层析方法。特种多缓冲交换剂PH降低混和蛋白质样品特种多缓冲液特种多缓冲液收集特种多缓冲液收集特种多缓冲液依次收集不同的蛋白组分5.层析聚焦(P310) 填充到层析柱中的树脂有阳离子交换型和阴离子交换型。支持介质： 对

27、蛋白质交换容量大阳离子交换剂阴离子交换剂CM纤维素(弱酸型)P纤维素(中强酸型)SE 纤维素(强酸型)SPSephadex(强酸型)AM纤维素(弱碱型)PAB-纤维素(弱碱型)DEAE-纤维素(中强碱型)DEAE-Sephadex(中强碱型)TEAE-纤维素(强碱型)QAESephadex(强碱型)6.离子交换层析(P310)以阳离子交换型树脂为例将带有耐酸性非常强的磺酸根SO3-Na（以盐的形式出现）的强阳离子交换树脂（固定相）填充到层析柱中。将含有样品的流动相加入层析柱中，样品中带有正电荷的蛋白质X，通过静电吸引，与树脂中的带电基团相互作用，结果X与Na交换（阳离子交换），形成SO3-X，

28、蛋白质就结合到了层析柱上。在样品与树脂充分交换后，可通过提高流动相中的盐浓度，或改变流动相的pH，或是同时采用这两种方法，就可以将结合于树脂上的蛋白质X成分，按照它们与树脂结合的强弱程度不同逐一地洗脱下来。结合到层析柱上的蛋白质的洗脱有不同的洗脱方式： 洗脱方式恒定浓度洗脱改变盐浓度或pH洗脱跳跃式分段洗脱渐进式连续改变(梯度洗脱)简单型混合器复合型混合器 利用待纯化的分子和杂质分子与吸附剂之间的吸附能力和解吸性质不同而达到分离目的。 典型的吸附剂：硅胶,氧化铝和活性炭等. 主要用来分离非离子、水不溶性化合物（四）利用选择性吸附的纯化方法(P312) 亲和层析(affinity chromat

29、ography)：是利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力, 即生物学亲和力，建立起来的一种有效的纯化方法。 经常只需一步处理即可将某种所需蛋白质从复杂混合物中分离出来，纯度相当高。(五) 利用与配体的特异生物学亲和力的纯化方法(P313)亲和层析把某一待纯化蛋白质的特异配体通过适当的化学反应共价地连接到像琼脂糖凝胶这一类的载体表面。向含有载体的层析柱中加入样品，样品中待纯化的蛋白质由于与载体上的配体结合而被吸附，而其它蛋白质和杂质成分通过平衡液的洗涤可以被除去。被特异结合的蛋白质可用含游离的相应配体溶液（高浓度洗脱液）洗脱(亲合洗脱)并进行收集。样品层析柱凝胶上的配体样品中待分离的的蛋白成

30、分 蛋白与凝胶上的配体特异结合在凝胶球上，其余未结合的样品成分被平衡液洗脱下来。样品凝胶上的配体样品中能与配体特异结合的蛋白成分高浓度的蛋白配体或者是类似物高浓度的蛋白配体或者是类似物蛋白质的分离纯化方法分子大小：溶解度：电荷：吸附性质：对配体分子的亲和力：透析和超过滤、密度梯度（区带）离心、凝胶过滤法等电点和PH值控制、盐溶盐析、有机溶剂分级分离、变温度电泳、离子交换层析亲和层析第三节 蛋白质分子量的测定(P291-299)一、根据化学组成测定最低相对分子质量 用化学分析方法测定出蛋白质中某一微量元素的含量,可以计算出蛋白质的最低相对分子质量。如Fe，并假设每个蛋白质分子中只有1个Fe原子，

31、则由此可算出蛋白质的最低相对分子质量。例如:某种蛋白含铁量为0.335%, 其最低相对分子质量(假设此蛋白只含有一个铁原子如肌红蛋白)可按下式计算出: 若此蛋白含4个铁原子（如血红蛋白） ，则：Mr = 16 700486 600最低相对分子质量Mr铁的原子质量铁的百分含量=55.80.335 100 =100 = 16 700即某蛋白的真实 Mr = 16 700n （n为含有的铁原子的数目）渗透现象：溶剂分子由纯溶剂（或稀溶液）向溶液（或浓溶液）单方向的净移动现象。二、根据渗透压法测定相对分子质量半透膜溶剂蛋白质溶液渗透压h渗透压测定的装置小分子可以通过，但蛋白质等大分子不能通过。Mr =

32、 RTlim (/c)c 0R: 气体常数； T：绝对温度；：渗透压； c: 溶质的浓度。注意事项：尽量采用等电点或者接近等电点的缓冲溶液做为半透膜内外的溶剂，以避免PH值对渗透压的影响。渗透压法测定蛋白质分子量的优缺点：优点：装置简单，准确度相对高。缺点：不能区别所测蛋白质溶液中的蛋白质样品是否均一。如果溶液含多种蛋白质成分，那么测出的是几种蛋白质的平均分子量。（三）蛋白质的扩散和扩散系数扩散（平移扩散）：由于浓度差引起的溶质分子的净迁移。扩散系数D：在数值上等于当浓度梯度为一个单位时，在一秒钟内通过1cm2面积所扩散的溶质量。扩散系数D的特点：(2)扩散系数一般不单独用来决定Mr ,但如后

33、面所说的与沉降系数结合起来,可以给出蛋白质的精确相对分子质量。(1)随 Mr的增加而降低,但扩散系数对Mr 的变化并不敏感。 （四）沉降分析法测定相对分子质量需转速为60,00080,000rpm的超速离心机 测Mr常用两种方法：沉降速度法沉降平衡法沉降：蛋白质分子在溶液中受到强大的离心力作用时，如果蛋白质的密度大于溶液的密度，蛋白质分子就会发生沉降，沉降的速度与蛋白质的分子大小、形状、密度以及溶液的性质有关。1. 沉降速度法测定相对分子质量 沉降系数(s):单位离心场的沉降速度。液面界面溶剂坪区池底 界面移动的速度即沉降速度，溶质的相对分子量越大，则界面移动越快，若溶液中有几种溶质，则离心之

34、后就会出现几个界面。界面移动的速度可以借助适当的光学系统来观察。如人血红蛋白沉降系数s=4.46S，即4.461013秒。 为了比较起见，在不同温度和溶剂中测得的沉降系数需要换算成标准条件下的s值。沉降系数的标准条件定为20C,溶剂为水。校正后的沉降系数用s20，w表示。 大部分生物大分子的沉降系数介于110-13到20010-13秒的范围。因此：把10-13秒作为一个单位，称为斯维得贝格单位或称沉降系数单位，用S(大写)来表示。 即：1S10-13秒Mr =RTsD（1V）R : 气体常数（8.314107ergsmol -1 度-1）T : 绝对温度D : 扩散常数（可用试验求得）V :

35、蛋白质的偏微比容（m3g-1）: 溶剂密度（20，gml-1） s : 沉降系数（可以根据沉降速度和离心力求得）蛋白质分子量与沉降系数的关系2. 沉降平衡法测定相对分子质量利用较低转速（800020000 r/min）进行。由于分子颗粒沉降造成浓度梯度，因而产生了扩散作用。x2x1离心力离心池轴心液面扩散力蛋白质的沉降平衡 2RTdln(c2/c1) (1-)2(x22-x12)Mr=R : 气体常数（8.314107ergsmol -1 度-1）T : 绝对温度V : 蛋白质的偏微比容（m3g-1）: 溶剂密度（20，gml-1）: 转子的角速度。c1、c2:距离旋转中心x1和x2处的蛋白质浓度。x2x1离