肺部感染的诊断难点：病原学诊断的规范化和新技术

1、2022/7/30Dr.HU Bijie1肺部感染诊断难点 -病原学诊断的规范化和新技术复旦大学附属中山医院Zhongshan Hospital of Fudan University胡必杰 Bijie HU患者男性，44岁，咳嗽、咳痰12天，气急5天痰少稍黄，发热39.2C，查体两肺湿性罗音；血WBC6500，P73；胸片示两肺炎症如何进行病原学检查？痰培养3次痰涂片革兰染色镜检痰找抗酸杆菌还有其他检查项目吗？2022/7/30Dr.HU Bijie2临床情景男性，咳嗽、咳痰加重1周，痰色稍黄，发热38.5C，查体于右下肺少许湿性罗音，胸片示右下肺炎。痰培养报告如下痰培养报告（1）铜绿假单胞

2、菌痰培养报告（2）铜绿假单胞菌 少量生长痰培养报告（3）无主要致病菌痰培养报告（4）铜绿假单胞菌草绿色链球菌奈瑟菌 2022/7/30Dr.HU Bijie3临床情景2022/7/30Dr.HU Bijie4The epidemiology of CAP among hospitalized adultsPorath A, Schlaeffer F, Lieberman D. J Infect 1997 Jan;34(1):41-8 ；Thorax 1996 Feb;51(2):179-84%病例：346。男占53% ，平均年龄 49.3 +/- 19.5（17-94）；方法： 1年。血和胸水

3、pleural fluid培养，特异血清试验确定病原结果：80.6%找到病原，133（38.4）为超过1种的病原体6214835101562019212022/7/3052022/7/30Dr.HU Bijie5如何规范地选择检验项目？肺部感染病原学诊断有哪些项目显微镜检查 革兰染色湿片检查分枝杆菌检查肺孢子菌检查（BAL）肺组织标本培养：细菌与真菌普通菌，厌氧菌，结核菌，真菌定量/半定量培养免疫学方法抗原：尿可溶性抗原，GM，隐球菌抗体：肺吸虫。组织病理学结核与其他分枝杆菌真菌（曲霉，隐球菌）分子生物学核酸检测其他2022/7/30Dr.HU Bijie6胸腔积液能做哪些检查？涂片检查对培养

4、阴性者的价值尤为重要普通培养将胸水直接注入血培养瓶内送检，可提高检出率。但可有皮肤非致病菌污染经胸腔留置导管采集的胸水标本，分离的细菌可能只是定植，应注意鉴别厌氧培养结核菌培养阳性率？抗原检测如流杆b型、肺链、军团菌或隐球菌2022/7/30Dr.HU Bijie72022/7/30Dr.HU Bijie8住院病人社区获得性肺炎单病种质量控制判断是否符合入院标准氧合评估病原学诊断住院24小时以内，采集血、痰培养在首次抗菌药物治疗前，采集血、痰培养抗菌药物时机入院8h/4h/6h内接受抗菌药物治疗起始抗菌药物选择重症与非重症患者起始抗菌药物选择目标抗感染药物的治疗选择初始治疗72小时后无效者，重

5、复病原学检查抗菌药物疗程（平均天数）为患者提供：戒烟咨询/健康辅导符合出院标准及时出院平均住院日/住院费用2022/7/30Dr.HU Bijie9上海市感染病原学诊断和耐药性监测评价指标 1病原学检测：治疗性应用“限制使用”与“特殊使用”类药物的病人，微生物标本送检率必须达到80以上。4随机抽过去1周内治疗性使用“限制”或“特殊”类药物的住院病历5份，了解用药前或开始用药后48小时内是否采集标本做微生物检验，包括细菌或真菌培养。5例中没有送检扣4分；仅1例送检扣3分；仅2例送检扣2分；仅3例送检扣1分。有4例或5例送检，不扣分。2. 正确掌握血培养指征：住院病人出现发热38，考虑感染所致，同

6、时伴有以下一种情况，应抽血培养：(1)对于留置深静脉导管超过48小时的患者；(2)医院内肺炎患者。4到ICU或病区，查找发热伴深静脉留置导管超过48小时和医院内肺炎，各2例。如缺少病例，可以从6月份的出院病例中查找。符合条件者，没有做血培养，每例扣1分。3血培养标本采集方法：怀疑有血流感染时，应在不同部位采血，至少2次。4到微生物室统计7月18日之前连续50例血培养数据当天2次采血培养人数占总体血培养人数的比例：6180，扣1分；4160，扣2分；2140，扣3分；20，扣4分4对常见感染部位病原谱与耐药性监测资料，应定期总结、分析，并向医院管理部门和医护人员公布。2过去一年有无对常见感染病原

7、谱和耐药监测资料进行总结分析和反馈。没有病原谱总结反馈、没有耐药监测资料总结反馈，每项扣2分。有总结但过于简单，每项扣1分。2022/7/30Dr.HU Bijie10香港玛丽医院微生物检验申请单改革微生物检验申请单2022/7/30Dr.HU Bijie11患者女性，44岁，咳嗽、咳痰12天，气急5天痰少稍黄，发热39.2C，外院胸片示两肺广泛炎症，以上肺为多，先后用青霉素、头孢曲松、头孢他啶等治疗无效。查体两肺湿性罗音。血WBC6500，P73。会诊要求如何选择抗感染药物？病原学检查情况痰涂片革兰染色镜检痰找抗酸杆菌军团菌抗体检测和军团菌培养临床情景右上肺空洞肺脓肿？痰培养厌氧菌培养结核空

8、洞？痰找抗酸杆菌结核菌培养肺真菌感染？2022/7/30Dr.HU Bijie12两肺弥漫性结节伴空洞男，65岁咳嗽数周无咯血、发热胸部CT示两肺多发结节伴空洞进一步检查？2022/7/30Dr.HU Bijie132022/7/30Dr.HU Bijie14某男，46岁，心脏移植术后2月余。高热5天伴咳嗽入院。CT示两肺炎症，之后应用万古霉素、泰能、氟康唑等多种抗菌药物治疗无效，仍高热，并出现进行性加重的呼吸困难。痰培养、血培养等均阴性会诊要求还要做哪些病原学检查项目？如何选择抗感染药物？临床情景2022/7/30Dr.HU Bijie15143新型隐球菌溶胶凝集试验2022/7/30162

9、022/7/30Dr.HU Bijie16如何规范地采集和运送标本？2022/7/30Dr.HU Bijie17关于咳痰标本在抗生素应用前采集痰标本;标本采集后12h内必须立即进行实验室处理；咳痰标本应用最早且广泛，但也是最受争议的标本 ;取标本前应摘去牙托，清洁口腔如刷牙和漱口;深咳，采集标本过程中要有专业的医务人员指导;无痰可用35NaCl 5ml雾吸约5min导痰；也可用物理疗法、体位引流、鼻导管抽吸等法取痰；对于细菌性肺炎，痰标本送检每天1次，连续23天。不建议24h内多次采集，除非痰液外观性状出现改变；怀疑分枝杆菌感染者，应连续收集3天清晨痰液送检2022/7/30Dr.HU Bij

10、ie18几种下呼吸道直接采集的标本经气管穿刺吸引transtracheal aspiration,TTA 经胸壁针刺吸引transthoracic needle aspiration, TNA 经支气管镜采样 支气管肺泡灌洗bronchoalveolar lavage, BAL经支气管镜直接吸引防污染样本毛刷protective specimen brush, PSB开胸肺活检open-lung biopsy，OLB经人工气道吸引分泌物 endotracheal aspirates，ETA2022/7/30Dr.HU Bijie19经支气管镜采样简单吸引、刷检、活检、灌洗(PSB,TBLB,P

11、BAL)方法多样、适应不同标本采集要求2022/7/30Dr.HU Bijie20经人工气道采样导管吸痰（ETA）防污染毛刷(PSB)防污染灌洗(PBAL)2022/7/30Dr.HU Bijie21经胸壁肺吸引、活检X线透视下、B超、CT引导下有一定的并发症气胸、出血、空气栓塞常用于贴近胸壁的病灶2022/7/30222022/7/30Dr.HU Bijie22如何规范地进行微生物检验？呼吸道标本的规范检验培养前处理痰标本质量评价痰标本的匀化定量或半定量培养培养条件培养平皿二氧化碳孵箱2022/7/30Dr.HU Bijie232022/7/30Dr.HU Bijie24细胞学筛选标本合格标

12、本应是从下呼吸道咳出的痰，内含颊部鳞状上皮细胞少，而白细胞较多不合格标本指唾液或唾液严重污染的痰标本，含鳞状上皮细胞多，而白细胞少2022/7/30Dr.HU Bijie25咳痰标本质量评估：细胞学筛选出处细胞学检查（每低倍视野）质量判定Manual of Clinical Microbiology 7th d，1999SEC10合格中华呼吸病学会.中华结核和呼吸杂志，1999SEC25合格SEC/ WBC1:2.5合格卫生部医政司全国临床检验操作规程（第二版），1997SEC25合格SEC25合格Bartlett法*总分13合格蔡文城临床微生物诊断学，1996SEC25适当SEC=1025，

13、WBC25可接受SEC25，WBC25可接受*SEC25，分别赋分0、-1和-2；WBC25，赋分0、1和2；粘稠或脓性痰液赋分值2022/7/30Dr.HU Bijie265种筛选标准判断14001份痰标本合格率比较 合格不合格不能归类标本数率标本数率标本数率标准1474033.9925366.1*80.1标准2358325.611097.9*930966.5标准3483234.5916965.5标准4911565.1488634.9标准5637845.6762354.42022/7/30Dr.HU Bijie27咳痰标本不合格，你退检吗？如果低倍视野下鳞状上皮细胞大于10个，应不做或仅在特

14、殊要求时做培养。如做培养，报告中注明“镜检结果表明标本口咽分泌物污染明显”。复旦大学中山医院的做法痰液外观：脓性，粘脓，粘液，水样.镜检：WBC？，SEC？痰标本质量评价：合格，不理想（建议重送）2022/7/30Dr.HU Bijie28痰标本的洗涤与消化洗涤灭菌等渗氯化钠液系列平皿内顺次漂洗，或置于孔径1mm的滤器上等渗氯化钠冲洗。洗涤可除去痰液外层水样唾液，保留来自下呼吸道的粘稠或脓性成分。消化乙酰半胱氨酸等消化液，以蛋白水解酶和粘液溶解剂应用最多。消化过程有助于痰核内部细菌的暴露，提高痰标本培养的阳性捡出率超声液化（？）2022/7/30Dr.HU Bijie29下呼吸道标本涂片染色镜

15、检初步病原学诊断：高质量痰标本涂片染色或湿片检查倾向性诊断：抗酸杆菌、放线菌、奴卡菌、一些真菌以及肺胞子菌、寄生虫。荧光显微镜：可用于军团菌、结核分枝杆菌等2022/7/30Dr.HU Bijie30革兰染色油镜检查可较清楚观察细菌的形态，大致判断细菌种属。一定特征性的病原体如肺炎链球菌、流感嗜血杆菌和卡他莫拉菌，经验丰富时可作出较为可靠的判定。在观察视野及周围不存在鳞状上皮细胞但见到一些炎性细胞或柱状上皮细胞的视野内，如发现较多形态单一的GNB，对肺部感染病原体的诊断有参考价值革兰染色镜检结果必须要立即向临床报告，尤其是ICU病人的经人工气道的吸引（ETA）标本痰标本巧克力琼脂培养基的接种，

16、仅限于每油镜视野10个类似嗜血杆菌或类似奈瑟菌。胸腔积液和脓胸做革兰染色涂片可明确细菌的类型和采取相对应的抗菌治疗方案。经支气管镜的冲洗液（除BAL）和支气管的抽吸物，口咽污染均不能避免2022/7/30Dr.HU Bijie31CAP: 痰液革兰染色作用不清楚目的: CAP病人痰革兰染色检测肺炎链球菌作用方法: 检索Medline 1966 to 1993英文发表论文 (检索词: sputum,Grams stain,pneumonia) 规则: 3 名盲法评述者独立判读文献入选: 11 篇前瞻性研究和 1篇回顾性研究共1322 pt证据: 敏感性15%100% , 特异性11%100%.

17、多数研究敏感性 70%评述: 70%系脓性痰. 缺陷:限Medline英文文献;样本数、研究规模、盲法、阳性结果的定义或抗生素使用对照与试验特征无统计学上的相关性Reed WW, et al: Sputum Grams stain in community-acquired pneumococcal pneumonia: a meta-analysis. Western Journal of Medicine 1996; 165: 197-2042022/7/30Dr.HU Bijie32湿片检查真菌检查：与含有10%甘油的10%KOH混合于载玻片上，盖上盖玻片，湿盒中放置1530min有经验

18、的技术员可轻易识别皮炎芽生菌、粗球孢子菌和新型隐球菌；可检出丝状菌；有动力的病原体，如一种引起二重感染的粪小杆线虫，可以在湿片中发现。鞭毛虫（？）2022/7/30Dr.HU Bijie332022/7/30Dr.HU Bijie34BAL离心沉淀物细胞学检查推荐微生物涂片数量染色方法细菌1革兰染色军团菌5荧光抗体染色真菌2Gomori乌洛托品银染色，湿片检查分枝杆菌3抗酸染色病毒含单克隆抗体染色测CMV、HSV等肺孢子菌3Gomori乌洛托品银染色2022/7/30Dr.HU Bijie35咳痰培养必须用半定量方法定性鉴定的普通培养方法不易区分感染菌或污染菌；标准定量培养方法繁琐，建议用半定

19、量方法；方法：四区划线接种标本进行培养，每划一区后均需火烧接种环，使细菌在平板上生长数逐级下降；报告：优势菌生长菌落为3+或3+以上。也可分大量heavy、中等量moderate和少量scattering生长三种；可以只鉴定和报告优势生长的需氧菌和兼性厌氧菌。只在原始区生长的少数菌不必作常规鉴定，除非临床或直接革兰染色提示可能为感染的病原菌。 2022/7/30Dr.HU Bijie36划线接种平板半定量判断标准分级划线区域菌落数原始区第二区第三区110210531055410552022/7/30Dr.HU Bijie37痰标本的培养基选择培养基包括分离和鉴别革兰阳性菌的血平板、革兰阴性菌鉴

20、别的平板如麦康凯平板；涂片显示嗜血杆菌样或奈瑟菌样的优势菌（每油镜视野10个细菌）时，应增加接种富含营养的巧克力平板，分离流杆、脑膜炎、卡他；痰涂片发现较多GNB或系医院内肺炎的痰标本，应加麦康凯平板；应少用培养平板进行细菌分离，要熟悉细菌在培养基上的生长模式，而不是靠选择培养基。2022/7/30Dr.HU Bijie38培养环境：CO2平板置于310CO2中35-37孵育。烛缸可基本达到这一要求，但近年来的研究显示用CO2培养箱分离肺炎链球菌和流感嗜血杆菌要明显优于烛缸。为提高细菌培养和分离质量，细菌室应常规配备CO2培养箱，呼吸道标本在初代培养时尤为重要。2022/7/30Dr.HU B

21、ijie39菌落观察与鉴定平板孵育过夜（18-24h），观察并记录有几种不同的菌落类型。咳痰标本：优势菌几种菌落应分离鉴定。直接采集的下呼吸道标本如PSB、BAL、TNA、胸腔穿刺液中生长的所有菌落类型均应鉴定。如果病人已接受抗生素治疗或革兰染色所见细菌未分离到，48h后应重新观察平板。某一菌落是否需要鉴定，应根据其引起下呼吸道感染的可能性和病例的临床特征来决定。 2022/7/30Dr.HU Bijie40链球菌溶血的链球菌：必须采样客观的方法如Optochin试验、胆汁溶解试验和荚膜肿胀试验，来鉴别草绿色链球菌和肺炎链球菌。草绿色链球菌：不要进一步鉴定至种水平。溶血性链球菌：至少应根据免疫

22、方法或杆菌肽敏感性测定，鉴定为A群和非A群链球菌。非溶血性链球菌：如此报告即可，不必鉴定至种水平。 2022/7/30Dr.HU Bijie41葡萄球菌金葡菌：致病力较强，必须与其他葡萄球菌相鉴别。其他葡萄球菌：很少引起下呼吸道感染，通常报告为凝固酶阴性葡萄球菌（CoNS）便可。如果是血液或通常为无菌部位标本如胸水分离出的细菌，或医院感染标本需要追踪传染源时，应进一步做有关生化试验将凝固酶阴性葡萄球菌鉴定至种的水平。 2022/7/30Dr.HU Bijie42卡他莫拉菌和脑膜炎奈瑟菌卡他莫拉菌：肺炎的常见病原菌，要分离、鉴定痰培养中的疑似卡他莫拉菌。奈瑟菌属：咳痰标本中分离的奈瑟菌通常不需要

23、鉴定到种。只有在临床医生建议、或涂片革兰染色有典型的特征即见大量胞内革兰阴性双球菌、或培养见大量单一形态的奈瑟菌纯培养，提示脑膜炎奈瑟菌是引起肺炎的病原体时，可作进一步鉴定。2022/7/30Dr.HU Bijie43嗜血杆菌流感嗜血杆菌：需510CO2，X和V因子副流感嗜血杆菌：临床分离很多，大多数系非致病的上呼吸道正常菌群2022/7/30Dr.HU Bijie44肠杆菌科在分离平板中容易被发现、分离和鉴定。采用同一标准处理肠杆菌科细菌和其他可能的感染病原菌。优势菌时，应分离鉴定到种的水平。多种GNB时，鉴定前，最好要与临床医生讨论其可能的临床意义（？）2022/7/30Dr.HU Bij

24、ie45革兰阳性杆菌呼吸道最常见的需氧或兼性厌氧革兰阳性杆菌是棒状杆菌。白喉棒状杆菌：主要引起上呼吸道感染，很少累及下呼吸道。咽拭子培养要留意此菌鉴别。类白喉杆菌：很少引起下呼吸道感染，不必进行鉴定，除非分泌物涂片染色检查系优势菌。类白喉杆菌可根据菌落和镜下形态进行报告，大部分菌触酶阳性。 2022/7/30Dr.HU Bijie46检查标本唾液？引导痰液？革兰染色（低倍100）(lpf x 100)*口咽部污染油镜1000# 血平板，麦康凯和巧克力琼脂孵育过夜（35oC + CO2）再孵育过夜草绿色链球菌表皮葡萄球菌类白喉杆菌奈瑟球菌拒绝标本取脓性部分鉴定与药敏试验最终报告Final rep

25、ort报告为“正常菌群”commensals*鳞状上皮细胞25或鳞状上皮细胞l25WBC105cfu/ml（2+）BALF：细菌104cfu/ml（1-2+）PSB、PBALF：细菌103cfu/ml（1+）2022/7/30Dr.HU Bijie50肺部细菌性感染病原诊断：有意义 合格痰标本培养致病或条件致病菌3+ 少量生长，但与镜检结果一致 （肺球、流感、卡他莫拉菌） 入院3天内多次培养到相同细菌2022/7/30Dr.HU Bijie51肺部细菌性感染病原诊断：无意义痰培养到上呼吸道正常菌草链、表葡、非致病奈瑟菌、类白喉杆菌等多种病原菌少量生长不符上述“ 确定”和“ 有意义”条款2022

26、/7/30Dr.HU Bijie52【病例】患者男性，咳嗽、咳痰加重1周，痰色稍黄，发热38.5C，查体于右下肺少许湿性罗音，胸片示右下肺炎咳痰培养结果：绿脓杆菌草绿色链球菌奈瑟菌肺部感染最可能的病原体？2022/7/30Dr.HU Bijie53【病例】患者男性，咳嗽、咳痰加重1周，痰色稍黄，发热38.5C，查体于右下肺少许湿性罗音，胸片示右下肺炎咳痰培养结果：绿脓杆菌草绿色链球菌奈瑟菌肺部感染最可能的病原体？2022/7/30Dr.HU Bijie54感染菌与污染菌的区分2022/7/30Dr.HU Bijie55阴性培养结果分析抗生素影响苛养菌特殊病原体检验技术受限采样运送不当非感染性疾病2022/7/30Dr.HU Bijie56普通培养基不生长的其他病原主要病原体厌氧菌：类杆菌、梭杆菌、厌