研究黄芪精中黄芪甲苷

1、研究黄芪精中黄芪甲苷含量测定的新方法发表人：卢晶晶扬子江药业集团有限公司飞跃QC小组Yangtze River Pharmaceutical Group扬 子 江 药 业 集 团1阳山书屋一产品概况黄芪精是我公司开发研制的虚症类OTC产品，为补血养气，固本止汗之良药。其疗效佳，口感好，携带方便。 Yangtze River Pharmaceutical Group扬 子 江 药 业 集 团2阳山书屋二.小组概况(一)小组简介 小组名称飞跃QC小组课题注册号TZ2005015课题类型创新型小组成员8人成立时间2005.10活动时间2005.102006.4课题名称研究黄芪精中黄芪甲苷含量测定的新

2、方法活动次数19次出勤率100%制表人：张集盘 日期：2006.3 .20Yangtze River Pharmaceutical Group扬 子 江 药 业 集 团3阳山书屋(二)QC小组成员一览表序号姓名性别受教育情况职务组内分工1张集盘男大专标准研究员组长，资料整理2黄新兰女本科，工程师，质量管理工程师QC主管副组长，技术指导3马 军男大专标准研究员方案实施4卢晶晶女本科标准研究员方案实施，成果汇报5陆莉娟女大专标准研究员方案实施6祖若玉女大专标准研究员方案实施7牛 萍女硕士，高工，质量管理工程师质管经理技术指导8季洪英女大专，工程师，质量管理工程师质管部长技术指导制表人：张集盘 日期

3、：2006.3.204阳山书屋三选择课题1.薄层扫描法测定黄芪精中黄芪甲苷含量的缺陷分析5阳山书屋1.1.扫描时基线不稳定6阳山书屋1.2.容易出现鬼峰7阳山书屋1.3.检测偏差大，方法的准确性较差8阳山书屋1.4.薄层板展开耗时长，且一块薄层板只能点一个批号的供试品，检测批次很有限，导致出成品检测报告的周期较长。1.5.按照部颁标准，以薄层扫描法 （TLCS）对黄芪精中黄芪甲苷进行含量测定，结果如下。9阳山书屋黄芪精按部颁标准含量测定结果批 号含量（mgml-1）含量平均值（mgml-1）相对平均偏差（%）030301-10.114120.105260.109694.1030401-10.1

4、10680.106490.108582.0030501-10.126550.119450.123002.9030601-10.120410.113520.116963.0030702-10.129010.119300.124164.0030801-10.125070.133710.129393.4制表人：张集盘 日期：2005.11.3TLCS法测定本品含量时偏差大，不利于产品质量的控制。10阳山书屋2.课题确定 研究黄芪精中黄芪甲苷含量测定的新方法可供直接借鉴的方法少黄芪化学成分复杂黄芪为君药黄芪甲苷为主要有效成分11阳山书屋四.设定目标拟制定黄芪精中黄芪甲苷含量测定的新方法的回收率不低于9

5、0%；含量测定结果的相对平均偏差小于2.0%。12阳山书屋五提出并选择最佳方案 1.提出方案（1）HPLC-UV（高效液相色谱-紫外检测器）法（2）HPLC-RI（高效液相色谱-示差折光检测器）法（3）HPLC-ELSD（高效液相色谱-蒸发光散射检测器）法13阳山书屋 2.方案的分析、评估与确定序号方 案 内 容原 理 分 析评估人方 案 评 估综合得分方案选定可操作性准确性经济性1HPLC-UV（高效液相色谱-紫外检测器）法利用黄芪甲苷在203nm处有末端吸收的原理,建立以乙腈-水（32：68）为流动相的HPLC-UV法张集盘44因在203nm处干扰大不选黄新兰马 军卢晶晶陆莉娟祖若玉牛 萍

6、季洪英14阳山书屋序号方 案 内 容原 理 分 析评估人方 案 评 估综合得分方案选定可操作性准确性经济性2HPLC- RI（高效液相色谱-示差折光检测器）法样品组分折射率与流动相溶剂折射率有差异，当组分洗脱出来时，会引起流动相折射率的变化，该变化与样品组分的浓度成正比 张集盘 32因灵敏度不高不选黄新兰 马 军 卢晶晶 陆莉娟 祖若玉 牛 萍 季洪英 15阳山书屋序号方 案 内 容原 理 分 析评估人方 案 评 估综合得分方案选定可操作性准确性经济性3HPLC-ELSD （高效液相色谱-蒸发光散射检测器）法 ELSD可以对所有挥发性低于流动相的物质作出准确检测,而与被检测物质的化学基团关系不

7、大,响应值与样品的质量成正比张集盘76因检测范围广、灵敏度高，故选定黄新兰马 军卢晶晶陆莉娟祖若玉牛 萍 季洪英 备注：可操作性、准确性、经济性三个指标均以1分（一般）、3分（良好）、5分（显著）为评分标准，上述综合得分为QC小组成员所评分数的总和。16阳山书屋3.确定方案的采用顺序（3）HPLC-ELSD（高效液相色谱-蒸发光散射检测器）法（1）HPLC-UV（高效液相色谱-紫外检测器）法（2）HPLC-RI（高效液相色谱-示差折光检测器）法PDCA17阳山书屋六制定对策 根据以上选择的最佳方案制订对策表对 策目 标措 施地 点时 间负责人色谱条件的确定峰形对称，目标峰与相邻峰分离度不小于1

8、.5，保留时间适中对不同的色谱柱、流动相、流速等进行摸索，尽量与药典中黄芪药材含量测定的色谱条件划一仪器室05.11.2105.11.28张集盘马 军供试品前处理方法的选择有效地提取目标物且操作方便摸索科学、准确的供试品前处理方法，尽量与药典中黄芪药材含量测定的前处理方法划一仪器室05.12.0505.12.17张集盘马 军卢晶晶陆莉娟18阳山书屋对 策目 标措 施地 点时 间负责人线性关系的确定 相关系数大于0.9990配制至少5个系列浓度，选择适当的曲线拟和类型进行确定 仪器室 06.01.0506.01.20 张集盘马 军卢晶晶精密度试验 峰面积的相对标准偏差RSD2.0% 同一供试品至

9、少连续进样5次，考查色谱峰面积的相对标准偏差（RSD） 仪器室 06.02.0506.02.11 张集盘马 军祖若玉19阳山书屋对 策目 标措 施地 点时 间负责人重复性试验 含量测定结果的相对标准偏差RSD2.0%同一批号的供试品同一人同一仪器平行操作6份，考查含量测定结果的相对标准偏差（RSD） 仪器室 06.02.1306.02.18 张集盘稳定性试验峰面积的相对标准偏差RSD2.0% 同一供试品分别在0、2、4小时进样分析，考查色谱峰面积的相对标准偏差（RSD）仪器室 06.02.2006.02.23 张集盘马 军卢晶晶祖若玉 20阳山书屋对 策目 标措 施地 点时 间负责人方法回收率

10、试验 方法回收率不低于90% 同一批号已知含量的供试品加入适量的对照品（或对照品溶液）平行操作6份，考查方法回收率 仪器室 06.02.2506.03.10张集盘马 军陆莉娟 制表人：张集盘 日期：2005.11.421阳山书屋七对策实施实施一：色谱条件的确定1.仪器与试药 Agilent1100高效液相色谱仪；Attech2000蒸发光散射检测器；梅特勒AG285电子天平。 黄芪精；天津农药总厂D101型大孔吸附树脂；甲醇、乙腈为色谱纯；95%乙醇为分析纯；水为超纯水。22阳山书屋2.对照品溶液的制备取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇溶解，配制成0.1 mgml-1的对照品溶液。3.供试品溶液的制

11、备精密量取本品10ml，置分液漏斗中，加水10ml，摇匀，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次20ml，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇10ml使溶解，0.45 m有机系微孔滤膜滤过，即得。23阳山书屋4.色谱条件的确定24阳山书屋色谱条件筛选图1色谱柱：Agilent XDB-C18柱（4.6150 mm，5m）流动相：乙腈-水 (40：60)柱温：40流速：1.2mlmin-1min24681012mAu100200300400500600700 ADC1 A, ADC1 CHANNEL A (ZJPHQJ21528.D) 1.405 7.

12、91725阳山书屋色谱条件筛选图2色谱柱：Agilent XDB-C18柱（4.6150 mm，5m）流动相：乙腈-水 (40：60)柱温：40流速：1.0 mlmin-126阳山书屋色谱条件筛选图3色谱柱：Agilent XDB-C18柱（4.6150 mm，5m）流动相：乙腈-水 (40：60)柱温：40流速：0.9 mlmin-127阳山书屋色谱条件筛选图4色谱柱：Agilent XDB-C18柱（4.6150 mm，5 m）流动相：乙腈-水 (40：60)柱温：40流速：0.9 mlmin-128阳山书屋色谱条件筛选图5色谱柱：Agilent XDB-C18柱（4.6150 mm，5m

13、）流动相：乙腈-水 (32：68)柱温：40流速：1.0 mlmin-129阳山书屋色谱条件筛选图6色谱柱：Agilent XDB-C18柱（4.6150 mm，5 m）流动相：乙腈-水 (32：68)柱温：40流速：1.0 mlmin-130阳山书屋色谱条件筛选图7色谱柱：Dikma DiamonsilTM（钻石）C18柱(4.6250 mm,5 m)流动相：乙腈-水 (40：60)柱温：40流速：1.0 mlmin-1前延峰31阳山书屋色谱条件选择情况汇总表制表人：马军 日期：2005.11.20色谱柱流动相不同流速（mlmin-1）下的对照品溶液色谱峰分离情况不同流速（mlmin-1）下

14、的供试品溶液色谱峰分离情况0.91.01.20.91.01.2Agilent XDB-C18柱（4.6150 mm，5 m）乙腈-水 (40：60)峰形对称；目标峰与相邻峰分离度大于1.5，保留时间适中峰形对称；目标峰与相邻峰分离度大于1.5，保留时间适中Dikma DiamonsilTM（钻石）C18柱（4.6250 mm，5 m）乙腈-水 (40：60)峰形对称；目标峰与相邻峰分离度大于1.5，tR10min峰形对称；目标峰与相邻峰分离度大于1.5，tR10minAgilent XDB-C18柱（4.6150 mm，5 m）乙腈-水 (32：68)峰形对称；目标峰与相邻峰分离度大于1.5，

15、tR10min峰形对称；目标峰与相邻峰分离度大于1.5，tR10minDikma DiamonsilTM（钻石）C18柱（4.6250 mm，5 m）乙腈-水 (32：68)峰形较对称；目标峰与相邻峰分离度大于1.5，tR10min峰形较对称；目标峰与相邻峰分离度大于1.5，tR10min32阳山书屋 因此，可以选择Agilent XDB-C18柱（4.6150 mm，5 m）、以乙腈-水 (32：68)为流动相，流速为1.0 mlmin-1进行后续试验。33阳山书屋实施二：供试品前处理方法的选择1.供试品溶液的制备精密量取本品10ml，置分液漏斗中，加水10ml，摇匀，用水饱和的正丁醇振摇提

16、取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次20ml，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水5ml使溶解，放冷，通过D101型大孔吸附树脂柱，以水50ml洗脱，弃去水液，再用A乙醇30ml洗脱，弃去洗脱液，继用B乙醇50ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解并转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，即得。34阳山书屋2.提取分离条件的确定收集上述水液和各拟弃去的乙醇洗脱液，蒸干，加甲醇适量使溶解，得溶液C按照上述色谱条件分别进样20 l，记录色谱峰面积。35阳山书屋各拟弃去的乙醇洗脱液蒸干，加甲醇适量使溶解，得溶液C水液30%40%50%60%70%80%95%黄芪甲苷峰检

17、出情况未检出未检出检出量较小检出量较大检出量最大未检出未检出未检出制表人:卢晶晶 日期:2005.12.1036阳山书屋试验结果表明：（1）弃去的水液中目标物无损失；（2）当A=40，即采用40%乙醇洗脱时，目标物有损失；（3）当B=60，即继续采用60%乙醇洗脱时，则目标物洗脱不完全。因此确定A%、B%的最佳值分别为：30%、70%，并以此值确定的提取分离条件进行后续方法学的验证。37阳山书屋实施三：线性关系的确定取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇溶解并稀释至8个系列浓度, 分别进样10 l，测定峰面积，以对照品浓度X(mgml-1)的lg值为横坐标，峰面积积分值Y的lg值为纵坐标进行线性回归，得

18、回归方程： Y=0.1819X+1.9515 r=0.999238阳山书屋工作曲线评价：结果表明黄芪甲苷在76.560255.20 gml-1 范围内线性关系良好。39阳山书屋实施四：精密度试验取同一供试品溶液，在上述色谱条件下重复进样6次，每次10 l，测得黄芪甲苷色谱峰峰面积平均值为978.57883，RSD为0.5%。40阳山书屋制表人：祖若玉 日期：2006.2.7进样次数峰面积峰面积平均值RSD（%）1977.09442978.578830.52980.079413975.409004986.095835976.362926976.4314041阳山书屋绘图人：祖若玉 日期：2006

19、.2.7评价：精密度良好，达到预期目标。42阳山书屋实施五：重复性试验取同一批号样品，制备6份供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液10l、20l，供试品溶液10l，注入液相色谱仪，测定峰面积值，以外标两点法对数方程计算，即得黄芪甲苷的含量。43阳山书屋重复性试验结果试验次数含量（mgml-1）含量平均值（mgml-1）RSD（%）10.1234380.1223571.20.12196820.1233660.12376830.1238620.12227040.1211760.12373450.1211650.11947860.1209460.123113制表人：张集盘 日期：2006.2.1444

20、阳山书屋 绘图人：张集盘 日期：2006.2.14评价：重复性试验RSD为1.2%，达到预期目标。 45阳山书屋实施六：稳定性试验取同一供试品溶液，于0、2、4、6、12、14 h分别精密吸取10 l注入液相色谱仪分析，测得峰面积值，计算RSD。 46阳山书屋稳定性试验结果进样时间（h）峰面积峰面积平均值RSD（%）01071.514771069.388771.821064.4517841077.6015661053.73657121098.48413141043.48083制表人：卢晶晶 日期：2006.2.2047阳山书屋绘图人：卢晶晶 日期：2006.2.20 评价：上述结果表明供试品溶

21、液在14 h内稳定性良好。48阳山书屋实施七：方法回收率试验 精密吸取已知含量同一批号样品5 ml，6份，分别精密加入已知浓度的对照品溶液5 ml，制备溶液，分别进样10 l，测得峰面积值， 计算平均回收率和RSD。49阳山书屋回收率测定结果（n = 6）取样量（ml）样品含量（mg）加入量（mg）测得量（mg）回收率（%）平均值（%）RSD（%）50.8219550.52701.3168893.9196.761.911.3248795.4350.8219550.52701.3455599.351.3418698.6550.8219550.52701.3305796.511.3396498.2

22、350.8219550.52701.3352697.401.3371497.7650.8219550.52701.3218994.861.3219794.8850.8219550.52701.3432198.911.3241195.29制表人：张集盘 日期：2006.2.2650阳山书屋评价：平均回收率为96.76%，RSD为1.91%，表明方法准确度良好，可以用于本品的定量分析。51阳山书屋评价1.初步评价建立了黄芪精中黄芪甲苷含量测定的新方法，方法学研究符合中国药典2005年版（一部）附录“中药质量标准分析方法验证指导原则”。52阳山书屋2.综合评价 取本品3批，将两法的含量测定结果进行对

23、比。53阳山书屋批号含 量（mgml-1）相对平均偏差（%）TLCS法平均值HPLC-ELSD法平均值TLCS法HPLC-ELSD法060313010.133960.1393240.1304560.1352832.60.70.1332480.127400.1381040.139324060314010.152920.1585610.1441870.1512221.91.20.1442410.147310.1578980.158561060315010.148710.1541390.1454340.1496721.80.70.1460540.143720.1530620.15413954阳山书屋

24、绘图人：陆莉娟 日期：2006.3.955阳山书屋评价：采用HPLC- ELSD法测定黄芪精中黄芪甲苷含量比采用TLCS法测定时的相对平均偏差小，测定的结果较理想。56阳山书屋八.效果检查1.效果验证取不同批号的黄芪精，依法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样10 l，测得峰面积值，并计算黄芪甲苷含量。10批样品含量测定结果见下表。57阳山书屋10批样品含量测定结果（n = 4） 批号含量（mgml-1）含量平均值（mgml-1）相对平均偏差（%）060102010.1573570.1586401.10.1565360.1602440.160424060120010.1554750.15556

25、60.60.1556130.1539920.157184060202010.1634490.1643911.40.1611400.1659520.16702358阳山书屋批号含量（mgml-1）含量平均值（mgml-1）相对平均偏差（%）060203010.1523720.1525030.50.1513820.1527150.153544060204010.1433190.1428430.80.1435370.1405860.143930060204020.1326390.1327960.40.1321470.1335680.13282859阳山书屋批号含量（mgml-1）含量平均值（mgml-1）相对平均偏差（%）060205010.1