Survivin基因反义寡核苷酸与大肠癌细胞凋亡、血管形成的体

1、Survivin基因反义寡核苷酸与大肠癌细胞凋亡、血管形成的体内试验研究李瑞 黄宗海 姚航 厉周 李强南方医科大学珠江医院普通外科，广东省广州市 510282李瑞，男，1974年生，河南省郑州市人，汉族，南方医科大学在读博士，主治医师，主要从事大肠癌基因治疗方面的研究。 HYPERLINK mailto:L L通讯作者：黄宗海，博士，教授，南方医科大学珠江医院普通外科，广东省广州市，510282Department of General Surgery，Zhujiang Hospital，South Medical University，Guangzhou 510282，ChinaLi Rui

2、, Studying for doctorate, Attending physician, Department of General Surgery，Zhujiang Hospital，South Medical University，Guangzhou 510282, China HYPERLINK mailto:L LCorrespondence to: Huang Zong-hai,Doctor,Professor, Department of General Surgery，Zhujiang Hospital，South Medical University，Guangzhou 5

3、10282, ChinaStudy on the effect of survivin ASODN in vivo to the apoptosis of colorectal cancer cell and vasiformationAIM: To study on the effect of survivin ASODN to the apoptosis of colorectal cancer cell and vasiformation in nude mice. METHODS: To build the model of colorectal cancer in nude mice

4、,and then we divided into four groups: control group, Lipofectamine group, Lipofectamine+SODN group and Lipofectamine+ASODN group.We compared the final weight of tumor and calculated the suppression rate of tumor. Hematoxylin and eosin stain of tumor tissues were performed for histological examinati

5、on .We detected the expression of survivin and microvessel density (MVD) of tumor and the apoptosis of tumor cell. RESULTS: The results showed that the final weight of tumor had conspicuous difference between Lipofectamine+ASODN group with other groups (P0.05). The pathological change showed that th

6、e growth of tumor was inhibited. The tissue section of tumor showed lamellar zone of necrosis and massive inflammatory cell infiltrate.The microvessel density (MVD) of tumor showed after treatment:control group (19.573.37); Lipofectamine group (21.944.41); Lipofectamine+SODN group (20.493.91); Lipof

7、ectamine+ASODN group (11.302.79). It had conspicuous difference between Lipofectamine+ASODN group with other groups (P0.05).The apoptotic index(AI) showed after treatment: control group (3.531.89); Lipofectamine group (3.862.14); Lipofectamine+SODN group (4.472.30); Lipofectamine+ASODN group (28.452

8、.76). It had conspicuous difference between Lipofectamine+ASODN group with other groups (P0.05). CONCLUSION: It hinted that survivin ASODN can inhibit the expression of vascular endothelial growth factor(VEGF) conspicuously and induce the apoptosis of endothelial cell and the devolution of micrangiu

9、m,which suppress the growth of tumor.目的：研究Survivin反义寡核苷酸对人大肠癌细胞裸鼠移植的瘤细胞凋亡及血管形成的影响。 方法：建立裸小鼠人大肠癌模型，然后将成瘤后的裸小鼠分为空白对照组，脂质体转染对照组，脂质体SODN对照组和脂质体ASODN组，治疗后测定瘤重并进行比较；将瘤组织进行HE染色，检测Survivin在瘤细胞内的表达；用SP法染色检测微血管密度(MVD)，用TUNEL法检测凋亡细胞，并探讨Survivin ASODN与MVD、AI之间的关系。 结果：ASODN实验组在第8日后测定最终瘤重，与各对照组在统计学上均有显著性差异（p0.05）

10、。常规病理下ASODN实验组可见肿瘤细胞生长受抑制，肿瘤组织切片中可见片状坏死区，而且这些区域可见大量炎性细胞浸润。空白对照组，脂质体对照组，脂质体SODN对照组MVD分别为19.573.37、21.944.41、20.493.91, ASODN实验组MVD为11.302.79，差异显著（P0.05）。空白对照组，脂质体对照组，脂质体SODN对照组AI分别为3.531.89、3.862.14、4.472.30，ASODN实验组AI为28.452.76，ASODN实验组AI与空白对照组，脂质体对照组，脂质体SODN对照组AI相比，差异显著（P0.05）。 结论：Survivin基因反义寡核苷酸可

11、显著抑制血管内皮生长因子的表达，导致内皮细胞凋亡和毛细血管迅速退化，从而达到抑制肿瘤生长的目的。关键词：Survivin基因；反义寡核苷酸；大肠癌模型；微血管密度0 引言在凋亡的调节因子中，凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)作为一种独特的细胞死亡调节因子引起了人们的注意，Survivin是由Ambrosini等在1997年发现的一个IAP家族的新成员，大多数正常组织均测不到Survivin基因表达，但在大多数恶性实体肿瘤中呈高度选择性表达1，它可以抑制细胞凋亡，并在新生血管的形成中有重要作用。Survivin反义寡核苷酸（ASODN）具有高度特

12、异性，能够明显抑制肿瘤的生长，故本研究旨在探讨Survivin反义寡核苷酸对人大肠癌细胞裸鼠移植的瘤细胞凋亡及血管形成的影响。1 材料和方法1.1 实验动物实验于2006-05/12在南方医科大学实验动物中心和珠江医院中心实验室完成。实验动物为4-6周龄BALB/C 裸小鼠，体重(19.21.3)g，由南方医科大学实验动物中心提供。12 主要试剂人大肠癌Lovo细胞由解放军广州军区总医院实验中心提供；阳离子脂质体(Lipofectamine TM2000)购自Invitrogen公司；鼠抗人CD34单克隆抗体为SantaCruz(美国)公司产品。Survivin正、反义寡核苷酸的设计、合成：根

13、据Survivin的基因序列(Genbank Accession NumberU75285)，应用primer5.0软件设计互补于Survivin mRNA的232-251序列的20个碱基组成的ASODN链，序列为5-CCCAGCCTTCCAGCTCCTTG-3，同时合成正义链，序列为5- CGCAGTAGCTGCGCTGATTG -3，两条序列每端5个磷酸基采用硫代修饰，由上海生工生物工程公司合成。1.3 方法细胞培养：水浴复苏人大肠癌细胞株Lovo后接种于30 ml培养瓶，在37，5 % CO2培养箱中用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液常规培养。裸小鼠人大肠癌模型的建立：将对数生

14、长期的人大肠癌细胞Lovo单细胞悬液浓度调整为3.5105/ ml，取0.2 ml接种于每只裸鼠的一侧背部靠左后肢处。接种后每天观察注射点有无破溃红肿，以皮下结节直径超过0.5cm为成瘤标准。实验分组及处理：将24只成瘤后的裸小鼠随机分成4组，为空白对照组，脂质体转染对照组，脂质体SODN对照组和400 ng/ ml浓度的脂质体ASODN组。各组均同时于成瘤后1，4，8d向瘤体内直接注射相应的试剂0.2 ml，定期观察皮下移植瘤生长情况。人大肠癌裸小鼠皮下移植瘤体积和重量的测量：分别于第一次注射后第1，4，8d观测裸小鼠肿瘤体积变化，并测量瘤体大小，8d后断颈处死裸小鼠，取肿瘤称重。肿瘤体积=

15、ab2/2 mm3(a:长径,b:短径)。光镜观察：将处死后的裸小鼠部分肿瘤组织用4%多聚甲醛固定，标本经石蜡包埋后连续4um切片，HE染色，光镜下观察人大肠癌移植瘤细胞形态变化。微血管密度(MVD)的检测：按Vltrasensitive TMS-P超敏试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司)说明进行操作。在低倍镜(40)选取切片中3个血管密度最高区域(排除肿瘤出血及边缘反应区)，然后在高倍镜下(400)计数每个区域的血管数量，其平均值即为肿瘤的MVD。脱氧核苷酸末端转移酶介导的末端标记(TUNEL)法检测凋亡细胞：应用细胞凋亡原位检测试剂盒(Boehringer Mannheim公司)染色，细

16、胞核呈棕黄色为阳性细胞。每张切片随机选择3个高倍视野(400)，计数1000个癌细胞中阳性癌细胞数，凋亡指数(AI)=阳性癌细胞数/1000100%。统计学分析：各组实验数据以均数标准差（s)表示，采用SPSS10.0统计软件进行单因素方差分析（显著性水准0.05）。2 结果2.1 Survivin ASODN对人移植瘤的抑制作用各实验组初始瘤体体积方差分析无显著差异，第8日后断颈处死裸小鼠，测定最终瘤重，ASODN实验组与各对照组在统计学上均有显著性差异（p0.05），各对照组之间无显著性差异。表1 各组移植瘤初始瘤体体积及最终瘤重（s)Table1 the beginning volume

17、 and final weight of tumor of the groups（s)分组n瘤体体积（mm3）最终瘤重（mg）空白对照组648.421.42498.1413.90脂质体对照组646.592.08502.6811.24脂质体SODN对照组647.442.05506.2010.40脂质体ASODN组647.221.58238.418.26*F值1.058843.095P值0.3890.000注：*：与空白对照组比较，P0.052.2 移植瘤病理变化（见图1）HE染色后，光镜下见各对照组人大肠癌移植瘤细胞密集成群，细胞多为多边形，核大深染。而ASODN实验组可见肿瘤细胞较少，分布稀疏

18、，有变性的液化坏死灶，癌细胞皱缩变圆，胞核固缩，核深染。Survivin ASODN与MVD、AI之间的关系检测肿瘤组织MVD（见表2、图2）：空白对照组，脂质体对照组，脂质体SODN对照组MVD分别为19.573.37、21.944.41、20.493.91, ASODN实验组MVD为11.302.79，差异显著（P0.05）。各实验组测定凋亡指数：空白对照组，脂质体对照组，脂质体SODN对照组AI分别为3.531.89、3.862.14、4.472.30，ASODN实验组AI为28.452.76，ASODN实验组AI与空白对照组，脂质体对照组，脂质体SODN对照组AI相比，差异显著（P0.

19、05）。表2 各组移植瘤MVD（s)Table2 MVD of tumor of the groups（s)分组nMVD空白对照组919.573.37脂质体对照组921.944.41脂质体SODN对照组920.493.91脂质体ASODN组911.302.79*F值14.896P值0.000注：*：与空白对照组比较，P0.05表3 各组移植瘤AI（s)Table3 AI of tumor of the groups（s)分组nAI空白对照组93.531.89脂质体对照组93.862.14脂质体SODN对照组94.472.30脂质体ASODN组928.452.76*F值256.766P值0.00

20、0注：*：与空白对照组比较，P0.053 讨论Survivin 是一个新的凋亡抑制蛋白，由142个氨基酸组成，N端含有一个杆状病毒IAP重复序列，其中含有对抑制凋亡有重要作用的氨基酸残基Pro33、Trp67和Cys84，survivin通过这些残基与caspase-3和caspase-7结合抑制caspase的活性，阻止多种凋亡信号诱导的细胞凋亡2-6。Survivin是迄今发现的作用最强的凋亡抑制因子。Survivin 选择性的在肿瘤组织中表达而在正常成熟的组织中不表达，并且参与了细胞周期的调控和新生血管的生成，因而Survivin 成为肿瘤诊断和治疗的新靶点7。Survivin 是生长因

21、子诱导血管形成中的保护性基因，在血管内皮细胞和新生血管的形成中有重要作用。有研究表明8，体外培养的血管内皮细胞在血管内皮生长因子（endothelial growth factor，VEGF）和碱性成纤维细胞因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）的刺激下，Survivin 表达上调 16 倍，其 mRNA 水平在610 小时达高峰，24 小时后开始下降，体外形成的三维血管与二维培养物相比，内皮细胞 Survivin 的表达显著增加。另外，在正常皮肤的非增殖性的毛细血管内皮中 Survivin 表达量很低，而在体内肉芽组织中的新生血管中 Survivin

22、的表达量很高。1984年，Izant和Weintraub提 出 了“ 反 义 核 酸 (antisense oligodeoxyribonucleotides，ASODN)”的概念9，即根据碱基互补原理，用人工或生物合成的特定互补的 DNA 或 RNA 序列导入靶细胞，形成mRNA-DNA 或 mRNA-RNA 杂交双链，从而抑制或封闭目的基因的表达，使其丧失活性，达到基因控制和治疗的目的。应用Survivin基因反义寡核苷酸可消除血管内皮生长因子（endothelial growth factor，VEGF）在血管形成中的细胞保护作用10。我们设计合成了互补于Survivin mRNA的23

23、2 -251序列的20个碱基组成的ASODN链，于400 ng/ ml浓度向瘤体内直接注射，使得微血管密度(MVD)显著降低，并与空白对照组，脂质体对照组，脂质体SODN对照组差异显著。本研究结果显示抑制生长因子表达，就可导致内皮细胞凋亡和毛细血管迅速退化，从而达到抑制肿瘤生长的目的，这是Survivin基因反义寡核苷酸抗肿瘤作用的重要机制之一。Survivin反义寡核苷酸目前已被认为是肿瘤的理想反义靶向治疗标志，随着基础研究的进一步深入，它必将应用于临床，成为恶性肿瘤的一种有效地治疗手段。4 参考文献1 Ambrosini G,Adida C,Altieri D C.A novel anti

24、-apoptosis gene,survivin,expressed in cancer and lymphoma.Nat Med,1997,3(8):917-921.2 Ma H,Nguyen C,Lee KS,et a1.Differential roles for the coactivators CBP and p300 on TCFbeta-catenin-mediated survivin gene expression.Oncogene,2005,24:3619-3631.3 Sun C,Nettesheim D,Liu Z,et a1.Solution structure of

25、 human survivin and its binding interface with SmacDiablo.Biochemistry,2005,44:11-17.4 Li F.Role of survivin and its splice variants in tumorigenesis.Br Jan cer,2005,92:212-216.5 Johnson ME,Howerth EW.Survivin:a bifunctional inhibitor of apoptosis protein.Vet Pathol,2004,41:599-607.6 Mc Neish IA, Lope s R,Bell SJ.et a1.Survivin interacts with SmacDiablo in ovarian carcinoma cells but is redundant in Smacmediated apoptosisExp Cell Res,2005,302:69-827. T. Yamamoto, N. Tanidawa. The role of survivin as a new target of diagnosis a