rol基因与植物次生代谢教学教材

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。rol基因与植物次生代谢-rol基因对植物次生代谢的影响摘要：Ri质粒不同于Ti质粒，仅存在于发根农杆菌中的另一类可作为植物基因工程载体的质粒，其上的T-DNA片段可以整合进入被发根农杆菌侵染的双子叶植物细胞的核基因组中，并稳定地遗传下去，产生的表型为植物发根瘤和再生转基因植株形态和发育异常，控制毛根形成的是T-DNA上的rol基因，rol基因不存在于Ti质粒上。本文介绍了rol基因对植物次生代谢中的功能，以及rol基因在信号传导中的作用。关键词：rol基因；次生代谢；发根农杆菌1发根农杆菌和Ri质粒发

2、根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)是根瘤菌科(Rhizoliacea)农杆菌属(Agrobacterium)的一种革兰氏阴性土壤细菌，外形呈杆状，具鞭毛，能侵染大多数双子叶植物和裸子植物及少数单子叶植物，在侵染部位能形成大量生长快、分枝多、失去向地性的不定根，称为毛状根(hairyroot)。利用发根农杆菌诱导植物细胞产生毛状根是20世纪80年代发展起来并得到广泛应用的植物基因工程技术，在植物代谢物的生产上显示了巨大的应用潜力。发根农杆菌在植物生物技术研究中，尤其是在遗传育种和基因工程研究中，发挥了极其重要的作用。Ri质粒具有两个主要的功能区即T-DNA(转移区)和Vi

3、r(致病区)，它通过T-DNA转移到被侵染植物中，使其生成毛状根。T-DNA在植物细胞基因组的整合和表达，导致毛状根的发生和再生转基因植株发育异常。根据发根农杆菌转化植物体合成冠瘿碱(Opines)的不同，可将发根农杆菌及其Ri质粒分为四种类型：农杆碱型(agropine-type)、甘露碱型(mannopine-type)、黄瓜碱型(cucronopine-type)和异黄瓜碱型(mikimopine-type)。农杆碱型Ri质粒的T-DNA有两个边界区域，即TL-DNA区和TR-DNA区，两个区域之间为一个非插入的DNA区。TL-DNA上存在与根的形态有关的基因，同时TL-DNA也影响再生

4、植株的茎、叶的形态和一些生理性状。TR-DNA上有生长素合成基因tms1和tms2，指导IAA的合成，因此转化产生的毛状根。甘露碱型、黄瓜碱型和异黄瓜碱型Ri质粒只有单一边界的T-DNA，与农杆碱型Ri质粒的TL-DNA有较高的同源性。农杆碱型Ri质粒的TL-DNA在转化细胞中整合的长度是相当固定的，而农杆碱型Ri质粒的TR-DNA整合的长度有很大变化。此外，在转化的毛状根克隆中可以有多个T-DNA整合，这些T-DNA或者独立存在(非连锁)，或者位于同一染色体上(连锁)。多T-DNA整合现象可能是多菌转化的结果，也可能是同一细菌向单个细胞转入多个T-DNA的结果。2rol基因Ri质粒是发根农杆

5、菌中位于染色体DNA之外的独立基因组，是仅存在于发根农杆菌中的另一类可作为植物基因工程载体的质粒，为双链共价闭合环状DNA。目前农杆碱型Ri质粒比较常见，rol基因是位于Ri质粒上T-DNA区的基因群(包括rolA、B、C、D基因)。现已证实，rolB基因和rolC基因是诱导植物生根的最主要基因。2.1rolA基因RolA蛋白是DNA结合蛋白中的一员，在结构上与乳头瘤病毒E2DNA结合域有很大的相似性。到目前为止RolA蛋白的生物化学功能尚不清楚。对rolA基因的研究表明，rolA基因能够刺激尼古丁生成。在茜草(Rubiacordifolia)愈伤组织中表达rolA基因，能够使醌类化合物(AQ

6、s)的水平提到2.8倍，同时通过长达7年的观察发现，rolA的表达也为愈伤提供了一个很好的生长环境。然而这些数据还不足以来就rolA对植物次生代谢的作用下定论。2.2rolB基因在rol基因家族中，rolB是对植物次生代谢最有影响的基因，对细胞生长的拟制作用也是最强的。在转基因茜草的愈伤组织中发现，rolB的表达水平与异分支酸合酶的表达水平成正相关，异分支酸合酶是合成AQ的一个关键酶，rolB通过影响异分支酸合酶来影响着AQ的生成。对茜草愈伤组织的生长参数的观察发现，rolB的高表达水平对愈伤组织的生长起拟制作用。有意思的是，rolA、rolC对愈伤组织的生长并没有拟制作用，当rolB与rol

7、A、rolC一起在愈伤组织中表达时，rolB的拟制作用被拟制了。与rolA和rolC相比，rolB对AQ积累的作用更大。在高水平表达rolB的组织中rolB能使AQ的水平提高15，然而在rolA、rolB和rolC一同表达的组织中，AQ的合成就少多了。在转rolB细胞中，拟制生长是一个限制因素，因为rolB编码一个具有酪氨酸磷酸化活性的蛋白，当通过使用酪氨酸磷酸酶拟制剂时，该拟制剂能阻止rolB对细胞生长的的毒害作用时，同时细胞中的次生代谢也随之降低。此外也报到rolB对植物次生代谢有促进作用。rolB对植物次生代谢有促进作用最早是在转rolB山葡萄细胞中发现的，在转rolB山葡萄细胞中，ro

8、lB的转录水平比野生型山葡萄高，并且白藜芦醇的积累量比野生型细胞的高100倍。白藜芦醇是一类重要的对称二苯代乙烯，能在肿瘤的引发、发展中阻止致癌作用。rolC基因rolC能刺激植物合成烷类生物碱、吡啶生物碱、植物碱、皂苷类化合物、醌类化合物。在转rolC基因植物细胞发现，rolC的表达量与尼古丁的产量和植物根的生长速度和密切相关。曾经有人提出了rolC刺激植物碱的合成是通过刺激植物的生长，而不是直接通过刺激根的合成活性的假说。然而在之后的研究中发现，rolC能刺激植物根合成植物碱。在不同种的植物，rolC刺激植物碱合成的活性不一样。在茜草转化的愈伤组织，rolC基因的表达导致了蒽醌含量的稳定增

9、加，与非转基因植物相比激活的程度为1.31.8倍的非转化细胞。通过对转基因植物长时间栽培观察（5年以上）发现，转rolC基因植株胼胝体中AQs的积累比非转基因植物的高2.04.3倍多。这表明随着时间的推移，转rolC基因植物中AQs的积累能够保持在一个稳定的水平上（Shkryl等人,2007）。研究还发现蒽醌类化合物的合成和ICS的基因的表达都依赖于rolC的表达强度：rolC基因的表达越高，ICS基因的表达和AQs的积累也越高。rolC基因提供了一个激活植物次生代谢过程的信号。除了刺激植物次生代谢外，rolC可能还赋予了植物更广泛的防御反应。在人参细胞中rolC的表达与-1,3-葡聚糖酶（P

10、R2家族）基因表达相一致。rolD基因rolD基因对次生代谢的影响还未开始研究，RolD蛋白是Rol蛋白中生化功能唯一明确的一个蛋白。基于生物信息学数据和直接的生化方法，Trovato等（2001）发现，rolD编码鸟氨酸环化脱氨酶，该酶能将鸟氨酸转换到脯氨酸上。在转基因细胞中，鸟氨酸池的减少和脯氨酸池的增加也是由于rolD的形态影响，比如维护毛根的生长和刺激植物开花（Trovato等人,2001）。有趣的是，通过测量PR-1基因表达发现，在番茄中表达的rolD能加强细胞的防御反应。rolA、B和C基因的联合效益目前通过观察毛状根（在毛状根中，基因的表达是在自己的启动子下控制着）的培养和其它的

11、T-DNA的基因研究了rolA、B和C基因的联合效益。这些调查表明，在大多数转基因植物中毛状根的次生代谢产物生产都有增加。毛状根产生大量次生代谢产物的能力是一个有趣的自然现象，哪一个T-DNA基因位点导致了这个结果？考虑到在转化植物细胞中，T-DNAROL基因位点对不同的生化过程有很大的影响，这个合理解释是导致次生代谢产物的增加的遗传决定因素是发根农杆菌的rol基因。研究发现，在不同转rolABC植物根部中次生代谢产物的积累与转野生型的毛状根中的积累很相似。在最近的调查显示，在转rolA、rolB基因和rolC基因，rolABC和pRiA4的茜草细胞中，每个rol基因似乎都有各自独立的AQ激活

12、机制。总的来说，这些基因在诱导高水平的二级代谢产物过程中发挥着重要的调控作用。虽然不排除还有额外的T-DNA的基因可对毛状根中次生代谢产物的影响，但这些额外基因的影响都很小。以前就有关于rol基因的拮抗作用就有不同程度的报道。rolB基因表达抑制了烟草细胞增长，而rolC基因能够削弱这种增长抑制作用。同样，在转基因细胞中，rolC基因还减少了由rolB诱导的细胞对生长素的敏感程度以及转化表型。有些数据表明，rolB和rolC基因的拮抗作用可能是由钙信号传导来调节。这可能是在野生型转化子激活的次生代谢中，rolB基因是一个重要因素，同时rolC基因在拟制rolB基因的作用时具有自己的信号途径。r

13、ol基因与植物抗病信号途径rol基因生物化学功能已有很多研究人员对Rol蛋白的进行研究了。早期研究表明，rolB基因和rolC蛋白为葡萄糖苷酶，分别从它们的结合形式中释放生长素和细胞分裂素，然而没有其他的证据支持这一假设，并推断在转rolC和rolB基因植物中，游离激素水平的变化，反映出致癌基因的非特异性效应。最近，Faiss等（1996）提出，RolC作为一种水解的植物细胞壁的非特异性的葡萄糖苷酶，从而通过释放的寡糖干扰植物发育。到目前为止。还没有其他能阐明RolC蛋白生化功能的研究。rolC基因产物的分子量为20.1kDa，但是值得注意的是植物和细菌葡萄糖苷酶都是相对分子质量高(50200

14、kDa)的蛋白（Slightom等，1985），这些蛋白的分子量都高于RolC蛋白。以硝基苯基-D-吡喃葡糖苷为底物，研究1c未转化和1c不同表达水平的转rolC基因的愈伤组织培养物中的-D-葡萄糖苷酶活性时发现，与其他碳水化合物酶相比，在所有的转基因植物中-D-葡萄糖苷酶活性都很低，相反的是在rolC转基因植物细胞中，-和-D-牛乳糖和1,3-D-葡聚糖酶的活性都比对照高310倍。凝胶渗透实验也表明在分子量为20kDa出的蛋白没有-D-葡糖苷酶活性。如果rolC基因产物为葡糖苷酶的话，那么这种酶应该是一种新的特异性的酶。rolC基因编码蛋白质的功能与此相反，在RolB蛋白的研究中这有两大突破

15、。研究发现RolB蛋白具有酪氨酸磷酸酶活性（菲利皮尼等人，1996），并与14-3-3蛋白相互作用。反过来，这些研究突出了在植物和动物中的一个平行致癌基因，因为酪氨酸磷酸酶和14-3-3蛋白在哺乳动物致癌基因中起着中枢的作用，并参与了细胞生长、分化和死亡等复杂的过程。Rol蛋白的酪氨酸磷酸酶功能需要进一步研究，因为在其他rolB基因蛋白中没有发现pRiA4rolB蛋白的CX5R基序中，而这个的酪氨酸磷酸酶家族特有的基序。也有证据证明了RolB蛋白参与了次生代谢，并具有酪氨酸磷酸酶功能。在转基因细胞中，酪氨酸磷酸酶抑制剂可以消除rolB基因调节的白藜芦醇和醌类化合物的刺激作用。目前对植物次生代谢

16、中酪氨酸磷酸化和14-3-3蛋白介导的生化过程还没有很清晰的了解。最近的研究表明，蛋白质酪氨酸磷酸化在植物中起着重要作用，调节MAP激酶的，转录因子的活性和ROS信号传导。最近，酪氨酸磷酸酶在植物中的存在也是有争议的，在拟南芥中有好几个蛋白酪氨酸家族。植物细胞不能产生高水平的白藜芦醇，加上低效率的标准生物技术方法为在体内白藜芦醇的检测造成了很大的问题，而rolB基因能刺激生产高含量的白藜芦醇克服了这个问题。3.2植物信号传导与rol基因植物防御激素茉莉酸甲酯、水杨酸和乙烯在植物防御反应的中发挥重要作用。虽然有实例证明NADPH氧化酶的的途径不参与植物抗毒素刺激过程，但是由NADPH氧化酶产生氧

17、化突发在植物抗毒素刺激过程中也发挥着重要作用。药理实验表明，rolC和rolB基因在蒽醌产生过程的作用不依赖于JA介导和依赖与Ca2+的NADPH氧化酶途径。研究发现在转rolC植物和野生型植物细胞中，乙烯与AQ植物抗毒素的产生无关联，这也说明rolC在蒽醌产生过程中与乙烯信号途径相互独立。然而SA以及rolC基因对蒽醌产生具有额外的刺激作用，这也暗示着还有其他刺激AQ生产的信号转导通路存在。在野生型或是转rolC和rolB基因茜草中以及转rolC基因E.sericeum的根中，斑蝥素（蛋白磷酸酶1和2A抑制剂）是唯一对次生代谢有显著影响的拟制剂。由于蛋白激酶/磷酸酶级联反应是激发子分子识别和

18、激活植物的防御反应的信号转导通路的一部分。一种转化的磷酸酶拟制剂能够诱导一种反应，这意味着蛋白的磷酸化在诱导反应体系中具有重要作用。在转rolC和rolB基因细胞中，由于斑蝥素能强烈激活植物次生代谢，致癌基因在刺激转基因细胞中斑蝥素敏感的Ser/Thr磷酸酶的表达非常重要。这些磷酸酶可能是通过刺激致癌基因在植物抗毒素产生上的刺激作用来调节的。在任何情况下，rolC和rolB基因引发的信号传导途径都有蛋白参与磷酸化/去磷酸化过程中。rol基因与ROS3.2.1rolB在ROS中的调节作用rolB在ROS中的调节作用目前还存在着异议。Shkryletal.（2008）发现在转rolB的R.cord

19、ifolia植物中蒽醌的含量特别高，特别是在rolB基因转录水平高的细胞中，由于rolB基因的坏死作用，因此人们推测rolB基因能诱导ROS产物，但是结果是相反的。Bulgakovetal.（2012）发现rolB基因能拟制ROS的产生，并且能下调或是消减ROS水平。也是由于rolB的这个作用，rolB细胞具有更高的耐盐、耐除草剂、耐甲萘醌、耐高压和H2O2。由于在rolB细胞，rolB只是上调部分抗氧化基因，并且还依赖于rolB基因的表达强度。因此Bulgakov假设在转rolB细胞中，细胞接受了一个来着rolB蛋白的信号，通过细胞补偿系统来执行这个信号，准确地调整抗氧化系统，当这个系统补偿

20、成功时，细胞维持着正常的氧化还原平衡，rolB表达过量时，系统补偿失败，导致了植物细胞坏死。3.2.2rolC在ROS中的调节作用在植物的防御反应中活性氧（ROS）起着关键的作用。为了阐明次生代谢与活性氧的关系，研究人员通过共聚焦显微镜和荧光染料的方法对茜草细胞进行观察，在转rolC茜草中发现ROS的稳定水平比野生型中的低。ROS的诱导能导致正常细胞中ROS的增加，但在转rolC细胞中的诱导效应却很小。这些结果表明rolC基因是一个功能强大的活性氧抑制。此外发现转rolC基因的细胞对盐、热和冷的忍受程度要比正常细胞高23倍。这些数据表明，致癌基因能激活多个效应子，并且ROS的产生与植物抗毒素的

21、产生是两条很明显分离的途径。当植物反应并激发后，ROS的放大则依赖于Ca2+离子流。有资料显示，转rolC和野生型的茜草细胞对H2O2诱导的Ca2+cyt的提高有着明显的不同，并且ROS的水平与H2O2诱导的Ca2+cyt离子流成正相关。如果在转rolC细胞中ROS和Ca2+cyt信号传导减弱了，致癌基因可能会通过这些重要的信号分子越过上游植物控制机制。3.3调节依赖Ca2+的蛋白激酶基因的表达在植物细胞中持续表达rolC基因会导致细胞对植物激素的敏感程度、体胚过渡和钙失衡以及PR2蛋白的激活和次生代谢。近年来，很多文章也论证了在根瘤菌微生物中，依赖Ca2+/钙调蛋白的蛋白激酶和依赖钙的蛋白激

22、酶(CDPK)在植物和根癌菌相互作用中起着重要作用。由于发根农杆菌与根瘤菌微生物有关，因此陈等人提出了一个合理的假设：发根农杆菌可以开发一个类似根瘤菌微生物的战略来影响宿主植物信号的分子。由于在调节植物信号传导途径的crosstalk中，CDPK是一个重要的调节分子，调节CDPK的表达和/或活性能解释很多在转rolC基因植物中很难解释的效应。事实上，最近实验显示在人参和Eritrichiumsericeum组织细胞中表达rolC能导致CDPK基因表达的改变，并激活了具有与催化丝氨酸/苏氨酸激酶子区域相似的修饰序列转录子的产生。有趣的是，在转rolC基因的人参，山葡萄和E.sericeum的细胞

23、中发现rolC基因表达水平能诱导CDPK转录子的缩短或是加长。因此rolC是通过改变各种CDPK基因的表达和产生新的CDPK转录子来影响各种生化过程。此外植物的耐盐性也是rol基因与CDPK有关的另一个例子，植物耐盐性是由CDPK的活性引起的，与Ca2+离子通道有关一种特性，当加入CDPK拟制剂后，人参细胞的耐盐能力明显下降。由于在转rolB和rolC基因的人参细胞组织的耐盐能力也比野生型的高，因此rolB和rolC的表达必定与CDPK基因的表达有某种程度的关联。通过DNA芯片和RT-PCR研究发现的人参耐盐性有关的CDPK基因有PgCDPK1,PgCDPK2,PgCDPK3和PgCDPK4a

24、。KISELEV（2009）在对转rol基因的人参细胞组织进行盐处理的实验中还发现，人参细胞组织还有会出现一个短暂的CDPK基因的表达，但是这短暂的CDPK基因表达并不是因为rolC基因引起的，而是植物细胞的一个自然的反应，除了CDPK基因的短暂的上调之外，目前还没有文献说明CDPKs基因的剪切和RNA编辑。4rolC的长期持续的影响有证据表明，长时间的培养会改变转rol基因细胞中细胞的生长、分化和次生代谢。比如用5个原始转rolC独立的人参转化子，经长时间的继代培养来研其根的形成能力，发现在315月后根才开始形成，1年半到5年后这五个形成了初始的肿瘤组织，并停止了根的形成，开始了体细胞胚胎和

25、根原基的形成。在长期的培养过程中转rolC基因的细胞培养也会改变。经过长达7年的茜草愈伤组织中的一项研究表明，转rolC基因转化的愈伤组织表型很保守，而且rolC的表达量很高，AQ水平也都很稳定。然而，在转rolC基因愈伤组织中、愈伤组织的生长参数发生了改变。在长期的培养中，不管rolC基因的表达高还是低，转rolC基因的愈伤组织的生长逐渐增加，而对照愈伤组织生长维持在一个稳定水平。在转rolC基因的Eritrichiumsericeum和Lithospermumerythrorhizon中还发现一个对次生代谢具有明显拟制作用的现象。在这两种植物中包含了大量的咖啡酸代谢物和迷迭香酸，这些物质都

26、具有很强的去抗肾炎的活性。在这两种植物的转rolC基因的愈伤组织中，咖啡酸代谢物都比对照低2到3倍。关于rolC基因对次生代谢的拟制作用的结论是通过长达两年的基于化学分析的观察而得出的，然而在之后的23年的研究发现转rolC基因的Eritrichiumsericeum中迷迭香酸的产量开始递增。在转rolC基因的人参中也得到了相似的结论。很明显，当rolC基因整合到植物基因组当中时，与时间相关的植物生长、分化和次生代谢能力也发生了显著的变化。但是这些效应很难解释，一方面主要因为致癌基因在基因组中的重排程度尚不清楚，另一方面是依赖致癌基因的突变程度也是未知的。研究rolC诱导肿瘤的特性具有很重要的

27、生物学意义，同时这些特性也与人类癌症基因组的突变过程相关的特性相似。5其他信号传导途径rolB和rolC可能通过改变植物传统机制来起作用。药理学实验表明rolC对植物抗毒素生产依赖于植物防卫素和依赖钙的NADPH氧化途径。与此同时，在转rolC的茜草细胞中AQs的生产不依赖于氧迸发。rolC和rolB可能通过短崭的关闭来绕过上游植物控制机制和识别防御反应，从而行使它们对次生代谢调节的功能。根据发根农杆菌和植物相互作用的进化发现，远古T-DNA参与了原始的入侵过程，并且在植物种类的分化上起着重要作用。因此我们也可以猜测rolC影响着重要的植物调节网络。6问题与展望目前rol基因已经开始应用到作物

28、的改良当中了，转化Ri质粒rol基因的植物不仅在生理代谢上发生了改变，而且在表型上出现一系列可稳定遗传的变异性状，包括改变植株的形状，降低顶端优势，促进根系形成以及影响开花与育性等强烈改变了植物生长发育模式的现象。这些为转rol基因提供了理论基础。然而，在rol基因表达的性状中，既有改良目的所需要的，也存在对育种目标不利的性状，如对多数植物导入rolA、B、C基因后，虽然能显著改善植株的生根能力，但转基因植株常伴随着顶端优势减弱，节间缩短，叶片皱缩等不良性状。彻底了解rol基因的功能，弄清其表达调控机制，进而做到有选择地控制rol基因的表达，已成为完善Ri质粒载体系统需要解决的问题。可以考虑对

29、rol基因启动子进行替换或改造来实现选择性控制rol基因的表达，也可考虑用反义RNA技术来控制rol基因在特定器官和组织中的表达。K.V.KISELEV,O.V.GRISHCHENKO,Y.N.ZHURAVLEV.2010.CDPKgeneexpressioninsalttolerantrolBandrolCtransformedcellculturesofPanaxginseng.BIOLOGIAPLANTARUM54(4):621-630KonstantinV.Kiselev,AnnaV,Turlenko,Yuri,.2009.CDPKgeneexpressioninsomaticembryosofPanaxginsengexpressingrolCPlantCellTissOrganCult.99:141149VictorP.Bulgakov,TatianaY.Gorpenchenkoetal.,.2012.TherolBGeneSuppressesReactiveOxygenSpeciesinTransformedPlantCellsthroughtheSustainedActivationofAntioxidantDefense.PlantPhysiology,158:1371138