生物化学教学课件：第11章  RNA的生物合成-3

1、DNA损伤与修复人类端粒DNA的四连体结构TTAGGGTTAGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGAATCCCAATCC端粒DNA序列（几百到几千个碱基对）染色体DNA55331. 绝大多数体细胞无端粒酶活性或端粒酶活性极低，端粒随细胞分裂而逐步缩短直至细胞衰老。. 端粒DNA序列长度相对固定，末端为DNA单链，形成四连体结构。有关线性染色体末端DNA (端粒)的复制端粒DNA末端形成模型3 G-rich overhange formedTTGGGG端粒DNA末端形成模型第11章RNA的生物合成RNA Biosynthesis ( Transcription )RNA的分子组成 R

2、NA DNA 单链 双链 核糖 脱氧核糖 尿嘧啶 胸腺嘧啶一级结构二级结构三级结构RNA 结构四级结构： 独立RNA间的相互作用，如核糖体和剪接体。RNA 类型参与蛋白质合成的RNAs: mRNA, tRNA, rRNA, 7SL RNA or SRP RNA, etc.参与RNA加工的RNAs : snRNA, snoRNA, gRNA, etc.调控 RNAs: miRNA, siRNA, piRNA, etc.基因组RNA: RNA 病毒参与逆转录的RNAs: 逆转录病毒基因组RNA, 反转坐子, 端粒酶 RNA. 本章主要内容：1. 原核生物转录的模板和酶2. 原核生物的转录过程3.

3、真核生物转录的模板和酶4. 真核生物的转录过程5. 真核生物RNA的加工6. 病毒RNA的复制在生物界，RNA合成有两种方式：一是DNA指导的RNA合成，也叫转录，此为生物体内的主要合成方式，也是本章介绍的主要内容。另一种是RNA指导的RNA合成(RNA-dependent RNA synthesis)，也叫RNA复制(RNA replication), 由RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase)催化，常见于病毒，是逆转录病毒以外的RNA病毒在宿主细胞以病毒的单链RNA为模板合成RNA的方式。 转录 (transcription) 是生物体以DNA为

4、模板合成RNA的过程 。 对于RNA生物合成过程的调节可以导致蛋白质合成速率的改变，以及由此而引发的一系列代谢变化， 因此了解RNA代谢的基本原理就甚为重要。这些原理既关系到所有生物是如何适应环境变化的，也关系到细胞结构和功能的分化机制。 复制和转录的相似之处 都是酶促的核苷酸聚合过程 都以DNA为模板 都需要DNA依赖的聚合酶 聚合过程都是核苷酸之间生成磷酸二酯键 按5 3方向延伸聚核苷酸连 都遵循碱基配对规律复制和转录的区别引物需要 不需要 参与转录的物质：原料: NTP (ATP, UTP, GTP, CTP) 模板: DNA酶 : RNA聚合酶(RNA polymerase, RNA-

5、pol)其他蛋白质因子Mg2+、Mn2+、Zn2+等金属离子原核生物转录的模板和酶Templates & Enzymes in Prokaryotic Transcription第一节 不对称转录(asymmetric transcription)有两方面含义：在DNA分子双链上，一股链用作模板指引转录，另一股链不转录；其二是模板链并非总是在同一单链上。一、原核生物转录的模板5335模板链编码链编码链模板链转录方向转录方向5GCAGTACATGTC 33 c g t g a t g t a c a g 55GCAGUACAUGUC 3NAla Val His Val C编码链模板链mRNA蛋白

6、质转录翻译 DNA双链中按碱基配对规律能指引转录生成RNA的一股单链，称为模板链(template strand)或反义链。相对的另一股单链是编码链(coding strand)或有意义链。 二、RNA合成由RNA聚合酶催化（一）RNA聚合酶能直接启动RNA链的合成DNA依赖的RNA聚合酶催化合成RNA；RNA合成的化学机制与DNA依赖的DNA聚合酶催化DNA合成相似。 ( NMP )n + NTP ( NMP ) n+1 + PPiRNA延长的RNADNA聚合酶在启动DNA链延长时需要引物存在，而RNA聚合酶不需要引物就能直接启动RNA链的延长。RNA聚合酶和DNA的特殊序列启动子(prom

7、oter)结合后，就能启动RNA合成。 J. Hurwitz分离并发现了RNA聚合酶1. 在E. coli提取液中加入DNA能够显著促进RNA合成；2. 从E. coli提取液中纯化出了RNA Pol，并证明该酶可以在DNA、NTPs、Mg2+或Mn2+的存在下体外合成RNA；3. 说明所合成的RNA与DNA完全互补，并预测合成的RNA参与了蛋白合成。（二）原核生物RNA聚合酶由多个亚基组成核心酶 (core enzyme)全酶 (holoenzyme)转录起始阶段转录延长阶段 + 存在多种s亚基 全酶的不同是因为亚基的不同 s亚基的功能是辨认转录起始位点 不同的s亚基用于不同的基因转录 启动

8、子识别区 -35 region -10 region70 辨认典型转录起始点的基因 TTGACAT TATAAT 32 辨认启动热休克诱导基因转录TCTCNCCCTTGAA CCCCATNTA28 辨认启动运动基因转录 CTAAA CCGATAT -24 region -12 region 54 辨认启动氮代谢基因转录 CTGGNA TTGCA三、RNA聚合酶结合到DNA的启动子上起动转录转录是不连续、分区段进行的。每一转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子(operon)。操纵子包括若干个结构基因及其上游(upstream)的调控序列。5335结构基因调控序列RNA-pol 启动子是RNA聚

9、合酶结合模板DNA并起始转录的部位。原核生物以RNA聚合酶全酶结合到DNA的启动子上而起动转录，其中由亚基辨认启动子，其他亚基相互配合。 Pribnow boxRNA聚合酶保护法开始转录T T G A C AA A C T G T-35 区(Pribnow box)T A T A A T Pu A T A T T A Py-10 区1-30-5010-10-40-205 3 3 5 RNA-pol辨认位点(recognition site) 55RNA聚合酶保护区结构基因33用RNA聚合酶保护法研究转录起始区Typical E.coli promoters recognized by an R

10、NA polymerase holoenzyme containing s70强启动子: 碱基排列及相对距离与共有序列非常相似。弱启动子: -35 和 -10 区的序列存在多种碱基替代。 共有序列：为多个序列比对所得到的一段理想序列，每个碱基代表着该位置上最常出现的核苷酸。RNA Pol 全酶在转录起始区的结合bbRNA Pol核心酶在转录延伸阶段原核生物的转录过程The Process of Transcription in Prokaryote第二节RNA聚合酶必须准确地结合在转录模板的起始区域。DNA双链解开，使其中的一条链作为转录的模板。一、转录起始需要RNA聚合酶全酶转录起始需解决两

11、个问题：E.coli的转录起始和延长 Sclavi B et al. PNAS 2005;102:4706-4711启动子识别的构型变化及开放复合物的形成2.形成开放转录复合体(open transcription complex)， DNA双链局部解开；1. RNA聚合酶全酶(2)与模板结合，形成闭合转录复合体(closed transcription complex) ；3. 在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形成转录起始复合物：RNApol (2) - DNA - pppGpN- OH 3转录起始复合物:5-pppG -OH + NTP 5-pppGpN - OH 3 + ppi转

12、录起始过程：4. 第一个磷酸二酯键生成后，亚基即从转录起始复合物上脱落，核心酶连同四磷酸二核苷酸，继续结合于DNA模板上，酶沿DNA链前移，进入延长阶段。 原核生物RNA 聚合酶抑制剂利福平：专一性地结合细菌RNA聚合酶 b 亚基，断RNA合成延伸。 二、 原核生物的转录延长1. 亚基脱落，RNApol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移； 2. 在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长。(NMP) n + NTP (NMP) n+1 + PPi转录延长：转录空泡(transcription bubble)：RNA-pol （核心酶） DNA RNARNA聚合酶53DN

13、A原核生物转录过程中的羽毛状现象核糖体RNARNA聚合酶在同一DNA模板上，有多个转录同时在进行；转录尚未完成，翻译已在进行。 这种形状说明：rRNA 基因簇的转录大肠杆菌mRNA 的转录与翻译相偶联原核生物的转录延长时蛋白质的翻译也同时进行。依赖Rho 因子的转录终止非依赖Rho因子的转录终止三、原核生物转录终止分为依赖(Rho)因子与非依赖因子两大类转录终止指RNA聚合酶在DNA模板上停顿下来不再前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来。 依据是否需要蛋白质因子的参与，原核生物转录终止分为： 因子是由相同亚基组成的六聚体蛋白质，亚基分子量46kD。因子能结合RNA，又以对polyC的结

14、合力最强。因子还有ATP酶活性和解螺旋酶(helicase)的活性。（一）依赖因子的转录终止因子的作用原理： r因子终止转录的作用是：与RNA转录产物结合(C-rich region)，结合后r因子和RNA聚合酶都可发生构象变化，从而使RNA聚合酶停顿，解螺旋酶的活性使DNA/RNA杂化双链拆离，利于产物从转录复合物中释放 。（二） 非依赖 Rho因子的转录终止DNA模板上靠近终止处，有些特殊的碱基序列，转录出RNA后，RNA产物形成特殊的结构来终止转录。 DNA 近终止区的转录产物形成发夹(hairpin)结构是非依赖因子终止的普遍现象。 茎环结构使转录终止的机理： 使RNA聚合酶变构，转录

15、停顿； 转录空泡中的DNA/RNA杂化链不稳定使转录复合物趋于解离，RNA产物释放。5pppG5 335RNA-pol真核生物的转录过程The Process of Transcription in Eukaryote第三节 真核生物的转录过程比原核复杂。二者的转录起始过程有较大区别，转录终止也不相同。 模板DNA RNA Pol 通用转录因子 其它反式作用因子一、 真核生物有三种DNA依赖性RNA聚合酶真核生物具有3种不同的RNA聚合酶:RNA聚合酶（RNA Pol）RNA聚合酶（RNA Pol）RNA聚合酶（RNA Pol ）真核生物的RNA聚合酶a-鹅膏蕈碱：与pol II相互作用、降低

16、聚合酶的转位以及RNA的合成速率。a-鹅膏蕈碱可用于区分 RNA Pol 的类型三种真核生物RNA Pol 的分离和鉴定离子交换色谱分离， a-鹅膏蕈碱鉴定 三种酵母RNA Pol都含四种核心亚基，与E. coli RNA Pol的 , 和 享有序列同源性。 仅RNA Pol II的最大亚基L含有一个必需的 C-terminal domain (CTD)。 RNA Pol I和III含有两个不同的-like 亚基,Pol II 的两个-like 亚基相同。 三种RNA Pol含有五种相同的亚基。 每种聚合酶含有47个独特的小亚基。Molecular Cell Biology. 4th edit

17、ion.Lodish H, Berk A, Zipursky SL, et al.Copyright 2000, W. H. Freeman and Company.酵母RNA Pol的组成以及与 E. coli RNA Pol 的比较E. coli coreRNA polymerase (a2bb)Eukaryotic RNA polymerasesb and b-like subunitsa-like subunitsCommon subunitsAdditional enzyme-specific subunitsII IIII+5+4+7RNA聚合酶最大亚基的羧基末端有一段共有序列(c

18、onsensus sequence)为Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser的重复序列片段，称为羧基末端结构域(carboxyl-terminal domain, CTD)。 CTD对于维持细胞的活性是必需的。RNA polymerase IIRNA聚合酶由12个亚基组成，其最大的亚基称为RBP1。 CTDIf any enzyme does the cells heavy lifting, its RNA polymerase IIArthur and Roger Kornberg二、转录起始需要启动子 、RNA聚合酶和转录因子的参与（一）转录起始前的上游区段具有启动子序列

19、不同物种、不同细胞或不同的基因，转录起始点上游可以有不同的、参与转录起始或转录调控的DNA序列，统称为顺式作用元件(cis-acting element)，包括启动子、启动子上游元件等近端调控元件和增强子等远隔序列。 一个典型的真核生物基因上游序列:53调控序列TATA盒InrYYAN YYTA-30+1TATAAA起始点上游多数有共同的TATA序列，称为Hognest盒或TATA盒(TATA box)。通常认为这就是启动子的核心序列。 转录起始点TATA盒CAAT盒GC盒增强子顺式作用元件(cis-acting element)种类：AATAAA切离加尾加尾识别序列OCT-1 具有保守的共有

20、序列，由转录因子介导RNA聚合酶II识别结合启动子上游元件，位于TATA盒上游，约-40-100nt的位置增强子是能够结合特异基因调节蛋白、促进邻近或远隔特定基因表达的 DNA序列。TATA box：典型启动子，一致序列为TATAAA，位于转录起始点上游约-30bp处，是RNA聚合酶的间接结合位点，决定了转录起始点。CAAT box：一致序列为GGGTCAATCT，是真核生物基因常有的调节区，位于转录起始点上游约-40-100bp处，控制着转录起始的频率。 GC box：位于CAAT框邻侧，由GGCGGG组成，是一个转录调节区，有激活转录的功能。 OCT-1：ATTTGCAT八聚体（二） 转录

21、因子能直接、间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质，现已发现数百种，统称为反式作用因子(trans-acting factors)。 反式作用因子中，直接或间接结合RNA聚合酶的，则称为通用转录因子(general transcriptional factors, TF)。相应于RNA Pol I、II、III的TF, 分别称为TFI、TFII、TFIII。型基因中的四类转录因子 转录因子 具体组分 结合序列 功能 基本组分 TBP,TFA,B,E,F和H TBP结合TATA盒 转录起始定位； 转录起始和延长 辅激活因子 TAFs和中介子 在可诱导因子和上游因子与基本转录因子、RNA聚合酶结

22、合中起联结和中介作用 上游因子 SP1、ATF、CTF等 启动子上游元件 协助基本转录因子，提高转录效率和专一性 可诱导因子 如MyoD、HIF-1等 增强子等远隔调控序列 时间和空间（组织）特异性地调控转录 参与RNA-pol转录的TFTBP是 TFIID的亚基，折叠成两个非常相似的结构域，可识别、结合 TATA box。TBP引起的DNA独特弯曲、解旋，可充当其它基本转录因子识别结合的标记。Three-dimensional structure of TBP (TATA-binding protein) bound to DNATFIIH 分为两个结构功能域：core TFIIH具有解旋酶

23、活性，XPD 和 XPB是解旋酶； CAK(cyclin-dependent activating kinase) 具有激酶活性，能使RNA-pol II 的CTD磷酸化。TFIIH structurePol IIIIHIIEIIFIIBTBPTAFIIATATA boxMyoD or HIF1可诱导因子GC or CAAT boxSP1 or CTF中介子辅激活因子通用转录因子上游因子与RNA Pol II 介导的转录相关的反式作用因子（三） 真核生物转录过程真核生物RNA-pol依靠众多的转录因子识别、结合启动子序列，形成转录起始复合物(pre-initiation complex, PI

24、C) 。 真核生物转录过程1. 转录起始前复合物 PIC的组装 TBP 结合到TATA box, 诱导DNA双螺旋弯曲； TFIIB-TBP complex 结合到 RNA pol II-TFIIF complex；TFIIE and TFIIH 参入形成闭合复合物。2. 在TFIIH作用下, DNA 解旋形成开放复合物6. 转录延伸7. 转录终止与多聚腺苷化相偶联4. RNA合成至 25-30 nt时，5端加帽3. 在TFIIH作用下, CTD 磷酸化引起Pol II构象改变，转录起始5. RNA 合成至60-70nt时， TFIIE 和TFIIH 依次释放8. Pol II 释放并去磷酸化

25、，参与下一轮转录。（四）少数几个反式作用因子的搭配启动特定基因的转录为了保证转录的准确性，不同基因需不同转录因子。拼板理论(piecing theory) ：少数几个反式作用因子（主要是可诱导因子和上游因子）之间互相作用，再与基本转录因子、RNA聚合酶搭配而有针对性地结合、转录相应的基因。可诱导因子和上游因子常常通过辅激活因子或中介子与基本转录因子、RNA聚合酶结合，但有时也可直接与基本转录因子、RNA聚合酶结合。三 、真核生物转录延长过程中没有转录与翻译同步的现象真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。 RNA-pol前移处处都遇上核小体。转录延长过

26、程中可以观察到核小体移位和解聚现象。 四、真核生物的转录终止和加尾修饰同时进行真核生物的转录终止，是和转录后修饰密切相关的。真核生物mRNA有聚腺苷酸(poly A)尾巴结构，是转录后才加进去的。转录不是在poly A的位置上终止，而是超出数百个乃至上千个核苷酸后才停顿。已发现，在读码框架的下游，常有一组共同序列AATAAA，再下游还有相当多的GT序列。这些序列称为转录终止的修饰点。真核生物转录抑制剂Actinomycin D放线菌素D：参入到dsDNA中连续的GC碱基对中、使DNA变构阻止RNA聚合酶沿模板链的移动，从而抑制RNA链的延伸。真核生物RNA的加工Eukaryotic RNA P

27、rocessing 第四节一、真核生物mRNA的加工包括首、尾修饰和剪接（一）前体mRNA在5-末端加入“帽”结构 大多数真核mRNA的5-末端有7-甲基鸟嘌呤的帽结构，7-甲基鸟嘌呤与相邻核苷酸之间通过5-5-三磷酸四酯键相连。 真核mRNA加工过程的起始步骤由两种酶，加帽酶(capping enzyme)和甲基转移酶(methyltransferase)，催化完成。加帽酶包括磷酸酶和鸟苷转移酶活性。5 pppGp5 GpppGppppG ppi鸟苷酸转移酶5 m7GpppGp甲基转移酶SAM5 ppGp磷酸酶 Pi帽子结构的意义（功能）：可以使mRNA免遭核酸酶的攻击；也能与帽结合蛋白质复

28、合体(cap-binding complex of protein)结合，并参与mRNA和核糖体的结合，启动蛋白质的生物合成。参与mRNA的穿核运输。 （二）前体mRNA在3端特异位点断裂并加上多聚腺苷酸尾 1. 尾部修饰是和转录终止同时进行的过程。2. 一般真核生物在胞浆内出现的mRNA，其poly A长度为100至200个核苷酸之间，也有少数例外。3. poly A的有无与长短，是维持mRNA作为翻译模板的活性，以及增加mRNA本身稳定性的因素。4. 前体mRNA分子的断裂和加多聚腺苷酸尾是多步骤过程。5. 前体mRNA断裂点上游1030nt有AAUAAA信号序列，断裂点下游2040nt有

29、富含G/U的序列。AAUAAAG/U53Poly(A)信号Poly(A)位点mRNACPSFG/U53CPSFCFI,CFII,CStFCPSFCStFCFICFIIPAPCPSFCStFCFICFIIPAP1. 断裂和聚腺苷化因子（CPSF，Cleavage and Polyadenylation Specificity Factor)结合 AAUAAA 信号；2. 断裂刺激因子(CStF, Cleavage Stimulatory Factor)结合 G/U序列，并与CPSF相互作用使RNA弯曲成环状；3. 断裂因子(CF, Cleavage Factor) 的CFI、CFII结合使复合物

30、稳定；4. 多聚腺苷酸聚合酶(PAP, Poly(A) Polymerase)的结合促使mRNA在断裂位点断裂 。PABCPSFAAAAAAAAAAOHPAPATPPPiPAB快速多腺苷酸化CPSFAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAHOAAAAAAAAAAPAPCPSFAAAAAAAAAAOHPAP6. 多聚腺苷酸结合蛋白II(PAB II, Poly(A) binding protein II)与已合成的poly(A)结合，促进PAP快速进行多聚腺苷化直至合适长度。5. CstF、CFI、CFII释放，PAP在断裂产生的游离-OH进行慢速多聚腺苷化，加入12个A；ATPG/UPPPiC

31、FIICFICStF慢速多腺苷酸化poly(A) 尾的功能:保护 mRNA免受核酸酶的降解；辅助转录终止;辅助mRNA出核运输至胞质;调控翻译速率。（三）前体mRNA的剪接主要是去除内含子鸡卵清蛋白成熟mRNA与DNA杂交电镜图1. hnRNA 和 断裂基因核内的初级mRNA称为杂化核RNA (hetero-nuclear RNA, hnRNA)真核生物结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因（split gene)。CABD编码区 A、B、C、D非编码区2. 外显子(exon)和内含子(in

32、tron) 外显子：在断裂基因及其初级转录产物上出现，并表达为成熟RNA的核酸序列。内含子：隔断基因的线性表达而在剪接过程中被除去的核酸序列。 鸡卵清蛋白基因hnRNA首、尾修饰hnRNA剪接成熟的mRNA鸡卵清蛋白基因及其转录、转录后修饰3. 内含子的分类 根据基因的类型和剪接的方式，通常把内含子分为4类： I ：主要存在于线粒体、叶绿体及某些单细胞生物的 rRNA基因； II：发现于线粒体、叶绿体，转录产物是mRNA； III：常见的形成套索结构后剪接，大多数mRNA基因有此类内含子； IV：tRNA基因及其初级转录产物中的内含子，剪接过程需酶及ATP。4. mRNA的剪接剪接：去除初级转

33、录物上的内含子，把外显子连接为 成熟的RNA。hnRNA剪接的场所发生在剪接体（splicesome)剪接体: 由小分子核糖核蛋白snRNP和mRNA前体组成，可将前体mRNA的内含子去除。snRNP(small nuclear ribonucleoprotein): 由一系列的snRNA和蛋白组成的复合物。包括: U1 snRNP, U2 snRNP, U4 snRNP, U5 snRNP, U6 snRNP snRNA: 5 types, U1, U2, U4, U5, U6 100300ntU-richpre-mRNA + snRNP (50 proteins + 5 snRNA) =

34、spliceosome大多数内含子都以GU为5端开始，以AG-OH-3为末端，5GU-AG-OH-3称为剪接接口或边界序列。剪接过程的化学反应称为二次转酯反应。剪接体的组装和剪接1. U1 和 U2 snRNA 分别与内含子 5 和 3端边界序列配对；2. U4-U5-U6 复合物加入形成剪接体；4. U1, U4 释放；3.内含子弯曲； 5. 发生第一次转酯反应； 6. 发生第二次转酯反应；7. 外含子连接，套索状内含子释放。形成套索状RNA的二次转酯反应E1: exon 1; E2: exon 2分枝点A的2-OH 进攻5剪接点的磷酸基，使 5 端exon 和 intron间磷酸二酯键断裂，在intron的 5末端和分枝点A间形成一个新的 52 磷酸二酯键，套索状的intron-3 exon RNA形成；5切割下来的exon的 3-OH 进攻3 剪接位点的磷酸基，释放出套索状intron ，生成剪接好的成熟mRNA。pG-OH (ppG-OH, pppG-OH)U-OHGpUpGpA第一次转酯反应第二次转酯反应UpAGpU外显子1内含子外显子2G-OHUpUpGpAI 型内含子自我剪接过程中的二次转酯反应不同类型内含子剪接途径比较I 和 II型内含子采用了与剪接体相似的剪接途径但不需任何蛋白的参与，这种