核算杂交技术聚合酶链反应

1、核算杂交(zjio)技术共一百零二页概述(i sh)分子生物学的重要方法之一使用特定标记的已知核酸序列与待测核酸进行特异性的杂交结合，形成杂交体，并利用相应的显示技术来检测目标(mbio)核酸的存在及其位置的分子生物学方法共一百零二页基本原理共一百零二页核酸(h sun)由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。核酸广泛存在于所有动物、植物细胞、微生物内、生物体内核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。不同的核酸，其化学组成、核苷酸排列顺序等不同。根据化学组成不同，核酸可分为核糖核酸，简称(jinchng)RNA；和脱氧核糖核酸，简称DNA。DNA是储存、复制和传递遗传信息的主要物质

2、基础，RNA在蛋白质合成过程中起着重要作用，其中转移核糖核酸，简称tRNA，起着携带和转移活化氨基酸的作用；信使核糖核酸，简称mRNA，是合成蛋白质的模板；核糖体的核糖核酸，简称rRNA，是细胞合成蛋白质的主要场所。共一百零二页核酸(h sun)的结构与特征核酸的结构一级结构：核苷酸以3，5磷酸二酯键构成(guchng)无分支结构的线性分子 二级结构：双螺旋结构 或局部双链三级结构：超螺旋结构 四级结构：DNA与蛋白质形成复合物 共一百零二页核算的结构(jigu)与特征核酸的特性核酸的变性作用(zuyng) 爆发式 Tm值核酸的复性作用 骤然冷却 缓慢冷却共一百零二页核酸(h sun)的杂交在

3、适宜的条件下，将不同来源的DNA放在试管里，经热变形后，慢慢冷却，让其复性。若这些异源DNA之间在某些区域有相同的序列，则可以通过互补碱基多之间非共价键（氢键）的作用，形成稳定的双链区，即复性形成杂交DNA探针（probe）：利用标记分子对其它分子的识别性而实现对后者进行检测的一种技术，通常(tngchng)把标记的分子叫探针探针技术与核酸分子杂交技术相结合共一百零二页共一百零二页核算杂交(zjio)的方法固相杂交固相支持物应具备的特征：1、具有较强的结合核酸分子的能力2、与核酸分子结合后，应不影响其与探针分子的杂交反应3、与核酸分子的结合稳定(wndng)牢固，能经受杂交、洗膜等操作过程而不

4、至于脱落或脱落很少4、非特异性吸附少，在洗膜条件下能将非特异性吸附在其表面的探针分子洗脱掉5、具有良好的机械性能固相杂交类型：Southern印记、Northern印记、组织原位杂交、菌落原位杂交等液相杂交共一百零二页核酸(h sun)探针的制备共一百零二页概述(i sh)核酸探针以研究和诊断为目的，用来(yn li)检测特定序列核算的DNA或RNA片段。共一百零二页核酸(h sun)探针的种类DNA探针(tn zhn)cDNA探针RNA探针寡核苷酸探针优点缺点共一百零二页核酸探针(tn zhn)的标记和检测放射性标记 32P和35S切口(qi ku)移位法随机引物延伸标记法末端标记法125I

5、标记RNA和DNA非放射性标记 生物素、洋地黄毒苷配体-dUTP、辣根过氧化物、碱化基团半抗原、荧光素、化学发光剂、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶间接标记法直接标记法DNA探针的吖啶酯标记共一百零二页Southern印迹杂交共一百零二页概述(i sh)Southern blotting将待测核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物上，即印迹固定于膜上的核酸同标记的探针在一定的温度(wnd)和离子强度下退火（复性），即分子杂交过程共一百零二页Southern blotting待测核算样品的制备与限制酶消化采集样本、提取(tq)DNA基因组DNA很长，通常用限制性酶消化共一百零二页Souther

6、n blotting琼脂糖凝胶电泳分离待测DNA样品目的(md)：按片断长短进行分离，确定杂交靶分子的大小琼脂糖凝胶浓度的选择电泳，EB染色，紫外灯观察凝胶共一百零二页Southern blotting电泳凝胶的预处理为了使DNA片段在合理的时间内从凝胶中移动出来，必须将最长的DNA片段控制(kngzh)在大约2kb一下0.25mol/L HCl短暂脱嘌呤，碱液浸泡，使DNA变性病断裂形成较短的单链DNA片段，用中性pH的缓冲液中和凝胶中的缓冲液，然后在20SSC中平衡凝胶10min共一百零二页Southern blotting转膜常用固相支持物：NC膜和Nylon膜常用转膜方法：细管虹吸印迹

7、(yn j)法、电转移法、真空转移法等共一百零二页Southern blotting探针标记预杂交与Southern杂交将膜上所能与DNA结合的位点全部(qunb)封闭，即预杂交的目的；预杂交后杂交2SSC淋洗膜后置于合适的容器中并加入10ml左右的预杂交溶液，65转动或摇动3-4h；煮沸探针5-10min使其变性，立即加入65预热的杂交液；倒去预杂交液并加完成的杂交液， 65转动或摇动过夜共一百零二页Southern blotting洗膜采用核素标记的探针(tn zhn)或发光剂标记的探针(tn zhn)进行杂交的关键一步放射性自显影检测X线底片曝光与洗片共一百零二页Southern blo

8、tting注意事项共一百零二页Northern 杂交(zjio)技术共一百零二页实验原理： Northern杂交是利用DNA可以与RNA进行分子杂交来检测特异性RNA的技术。其基本原理和程序与Southern杂交类似，基本过程包括RNA的提取(tq)，琼脂糖凝胶电泳分离，将变性的RNA从凝胶向滤膜转移，然后与滤膜结合，最后用标记探针对固定在膜上的RNA进行杂交，用放射自显影等方法显示与标记探针序列互补的目的条带。 共一百零二页 由于RNA极易降解，而RNA酶不仅无处不在，而且很难消除，所以在操作过程中必须采取必要的措施，包括使用专门准备的用具、试剂和溶液等，所有溶液尽量用DEPC处理后高压消毒

9、(xio d)的高质量去离子水制备。由于手汗含有大量的RNA酶，因此操作人员必须戴防护手套。共一百零二页实验步骤： 1、进行RNA琼脂糖凝胶电泳 2、RNA变性 3、将RNA转移到尼龙膜上 4、使RNA与尼龙膜结合 5、RNA与探针杂交 6、洗去非结合探针 7、放射自显影显示与标记探针序列(xli)互补的 目的条带共一百零二页 变性(binxng)： 由于RNA直接与尼龙膜结合力差，且具有茎环结构，必须将RNA先经变性剂（甲醛/羟甲基汞/戊二醛）处理，一方面使RNA变性，另一方面可促进RNA与滤膜有效结合。 注意：RNA变性与DNA变性方法不同，不能用碱变性，否则易引起RNA水解。共一百零二页

10、 转移： 用刀片修饰凝胶，弃去不需要部分和加样孔以上部分，并在一角切成三角形缺口以做记号。剪取一张略大的尼龙膜，一角剪成与凝胶缺口同样大小的三角形缺口，将膜漂浮(pio f)在一盘去离子水表面，待完全侵湿后在10倍SSC中侵泡至少5min。 转膜有两种方法：电转移法和毛细管转移法共一百零二页毛细管转移(zhuny)法图示：共一百零二页 电转移法图示：共一百零二页 取出尼龙膜，甩掉多余液体，将有RNA的一面朝上，在滤纸上晾几分钟。 将尼龙膜晾干(lin n)后，夹在两滤纸之间，在真空烘烤箱中80烘烤2h。共一百零二页杂交 将放射性同位素标记的DNA探针(tn zhn)经100 煮沸5min和冰浴

11、2min变性，然后将探针(tn zhn)和膜放入袋中杂交，在68水浴中杂交过夜。 共一百零二页 杂交结束后，将尼龙膜在一定量的0.1% SDS-1倍SSC中室温下轻轻摇动(yo dng)洗涤10min，然后在一定量的预热至68的0.1%SDS-0.5倍SSC中洗涤3次。 共一百零二页 注意事项： 1、EB会影响RNA与尼龙膜的结合，所以在胶中不能加核酸染料(rnlio)EB。 2、实验所用的器具、试剂以及实验环境一定要防止RNase的污染。 3、所有用于Noethern印迹的溶液均需用DEPC处理后高压消毒的高质量去离子水制备。 4、操作人员必须戴防护手套和口罩，防止RNase污染和操作人员吸

12、入DEPC中毒。共一百零二页聚合酶链反应共一百零二页基因(jyn)扩增（gene amplification) 指生物体内或体外基因拷贝数大规模增加。PCR扩增：应用聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术，在体外酶促合成特异DNA片段(pin dun)的一种方法。基因扩增技术-PCR共一百零二页DNA的复制(fzh)（1）3-OH进攻5- PiDNA聚合酶催化(cu hu)DNA的延伸方向:5-3共一百零二页DNA的复制(fzh)（2）DNA复制相关蛋白在复制起始点打开(d ki)双链DNA然后DNA解链酶结合到单链DNA上进一步解开双链DNA 共一百

13、零二页DNA的复制(fzh)（3）共一百零二页PCR技术(jsh)的创建 Kary B. Mullis（穆利斯（美）Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性(binxng),与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术。1989年美国Science杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。共一百零二页故事(gsh)发生在1983年的春夏之交共一百零二页Kary B.

14、Mullis (1944 -)，在Cetus公司工作期间，发明了PCR。 他原本是要合成DNA引物来进行测序工作， 却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年春夏之交的一个晚上，他开车去乡下(xing xia)别墅的路上萌发了用两个引物（而不是一个引物）去扩增模板DNA 的想法.很少有在公司工作(gngzu)的科研人员得诺贝尔奖， Mullis是其中之一共一百零二页Mullis开车的时候, 瞬间感觉两排路灯(ldng)就是DNA的两条链，自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成着DNA共一百零二页Mullis的第一个PCR实验(shyn) 1983年9月中旬， Mullis在反

15、应体系中加 入DNA聚合酶后在37 一直(yzh)保温。结果第二 天在琼脂糖电泳上没有 看到任何条带。于是他认识到有必要用加热来解链，每次解链后再加入DNA聚合酶进行反应，依次循环。1983年12月，他终于看到了被同位素标记的PCR条带。共一百零二页945537共一百零二页基本原理PCR是一种体外酶促合成特异DNA片段的新方法它由一对引物介导，与模板DNA特异结合，选择性地扩增特异的DNA片段反应体系包括：DNA靶序列、引物、四种三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）、耐热(nai r)DNA聚合酶、合适的缓冲液体系共一百零二页PCR技术(jsh)的三步反应共一百零二页PCR循环(xnhun)-变性共一

16、百零二页PCR循环(xnhun)-变性共一百零二页PCR循环(xnhun)-变性共一百零二页PCR循环(xnhun)退火共一百零二页PCR循环(xnhun)延伸共一百零二页PCR循环(xnhun)延伸共一百零二页PCR循环(xnhun)延伸共一百零二页PCR循环(xnhun)延伸共一百零二页PCR整个(zhngg)过程共一百零二页共一百零二页PCR的基本原理PCR反应(fnyng)条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性

17、形成2条单链模板(mbn)DNA95共一百零二页PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程(guchng)PCR的特点50引物1引物2DNA引物共一百零二页PCR的基本原理PCR反应(fnyng)条件PCR过程PCR的特点引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶共一百零二页PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程(guchng)PCR的特点 第1轮结束(jish)第2轮开始95共一百零二页PCR的基本原理PCR反应条件(tiojin)PCR过程PCR的特点72TaqTaqTaqTaq共一百零二页PCR的基本原理PCR反应(fnyng)条件PCR过程PCR的特点第2轮结束(jish)共一百零二页

18、PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程(guchng)PCR的特点模板(mbn)DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增共一百零二页PCR的技术(jsh)路线共一百零二页PCR的基本(jbn)步骤体系（加样方法） 10PCR缓冲液 10ul DNA模板(mbn) 0.1-1ug dNTP（2mmol/L） 各10ul 两种引物（10-50umol/L） 各1-2ul ddH2O（灭菌） 加至100ul 离心15s，加石蜡共一百零二页PCR的基本(jbn)步骤PCR循环 预变性 97，2-5min，迅速冷却至室温(sh wn) 加入TaqDNA聚合酶 主循环 变性94

19、 30-60s 退火55 30-60s 延伸72 60-150s 循环25-35次 终延伸 72 5-10min共一百零二页共一百零二页PCR的反应(fnyng)体系及其优化共一百零二页概述(i sh)模板引物缓冲体系一价或二价(r ji)阳离子四种dNTP耐热DNA聚合酶共一百零二页模板(mbn)模板(mbn)的纯化模板DNA片段大小适宜的模板量共一百零二页引物 引物：决定PCR反应的特异性 PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度 理论上，只要(zhyo)知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用 PCR就可将模板DNA在体外大量扩增共一百零二页 基本原

20、则是最大限度地提高扩增效率和特异性，同时(tngsh)尽可能抑制非特异性扩增。引物设计(shj)的原则共一百零二页引物引物的长度引物的扩增跨度引物的组成(z chn)引物3端配对引物的浓度共一百零二页引物长度： 15-30bp，常用20bp左右 引物的有效长度不能大于 38 bp，否则最适 延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度 （74），不能保证PCR扩增产物(chnw)的特异性引物扩增跨度：以500bp为宜 特定条件下可扩增长至10kb的片段共一百零二页引物碱基：G+C含量以40-60%为宜 G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带 ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤

21、或嘧啶核苷酸的成串排列，尤其3端不应超过3 个连续的G或C，因为这样(zhyng)会使引物在G+C富集区 引发错误延伸避免引物内部出现二级结构和引物间互补 特别避免 3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异性的扩增条带 共一百零二页共一百零二页引物 3端的碱基要求严格配对（不能做任何修饰） 特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端 碱基不配对而导致PCR失败引物5端可修饰 引物5端限定着PCR产物的长度，但对扩增特异性影响不大；引物5端碱基可不与模板(mbn)DNA 互补而呈游离状态；引物5端最多可加10个碱 基而对PCR反应无影响 共一百零二页引物的特异性： 引物应与核酸序列数据库的其它

22、(qt)序列无明显同源性引物量： 每条引物的浓度0.1 0.5M，以最低引物量产生所需要的结果为好引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会共一百零二页技术(jsh)举例共一百零二页共一百零二页共一百零二页共一百零二页共一百零二页共一百零二页共一百零二页共一百零二页共一百零二页共一百零二页耐热(nai r)DNA聚合酶目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应 天然酶：从水生嗜热杆菌中提纯 基因工程酶：大肠菌合成(hchng)一个典型的 PCR反应约需酶量1- 2.5U/100 ul体系浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少共一百零二页Taq DNA 聚合

23、酶Taq DNA 聚合酶的功能Taq DNA 聚合酶的特性(txng)Taq DNA 聚合酶的使用量Taq DNA 聚合酶的影响因素共一百零二页三磷酸(ln sun)脱氧核苷酸在PCR反应中，dNTP应为50200M，浓度过低会降低PCR产物的产量注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制 ）,如其中(qzhng)任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配高浓度的dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性共一百零二页二价(r ji)阳离子Mg2+Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响在一般(ybn)的 PCR反应中，各种dNTP浓度为200u

24、mol/L时，Mg2+浓度为1.52.0 mmol/L为宜Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少共一百零二页PCR反应(fnyng)条件的优化共一百零二页概述(i sh)温度循环参数PCR反应(fnyng)促进剂液态石蜡反应体系中各因素的相互作用共一百零二页 变性(binxng)温度与时间：一般9394，1min足以使模板变性(binxng)若低于93则需延长时间但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。共一百零二页 退火(复性(f xn)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的重要因素退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度(nngd)，还有靶基因序列的长度对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55作为选择最适退火温度的起点较为理想共一百零二页引物的复性温度通过以下公式帮助(bngzh)选择合适的温度：