2015年第10讲+细胞膜的生物物理学-01

1、1 Membrane Biophysics 01第十讲 膜的生物物理学杨永亮2015年2分子生物物理学 (蛋白质折叠、单分子、病毒等)生物物理学的实验方法 (分子成像、X-射线、冷冻电镜、GFP等技术) 膜的生物物理学前沿生物物理学 (干细胞、蛋白质组学等)神经生物物理学医学生物物理学生物物理学纲要3生物物理学的基本思路是相互作用(interactions)和相互识别(recognition)！4引言What is membrane biophysics ?膜生物物理学是研究生物膜结构、物理化学性质和相互作用的学科5生物膜的主要功能它们是把细胞分割成一个个“小室” (compartment)

2、的物理屏障。它们具有选择通透性。它们是“小室”间传递化学信息和能量的介面。它们为蛋白质的合成、加工与修饰、分选与定位，提供了工作平台和输运载体。6Membrane ArchitectureMolecular Biology of the Cell, Third edition, N.Y. 1994 7Basic Components生物膜的基本组成8 1. 脂质及脂质聚集体9 什么是脂质 (lipids)?脂质是一类脂肪类物质脂质是生物膜的重要成分脂质是形成生物膜的基础脂质相互作用遵从物理化学规律101. 1 膜脂质的类型磷脂 (phospholipid)甘油磷脂 (glycerophosph

3、olipid)鞘磷脂 (sphingomyelin)糖脂 (glycolipid)类固醇 (steroid)11 甘油磷脂的一般结构式(GPL) R1, R2为脂肪烃链 R1一般为不饱和 R2一般为饱和 X为极性基团12甘油磷脂glycero-phospholipids是细胞膜的主要成分存在于所有生物中形成生物膜的骨架-脂双层PCPEPSPGCLPI13 鞘磷脂主要存在于动物的脑， 神经，血液中 植物及微生物细胞中很少鞘磷脂鞘氨醇神经酰胺(SM)14 鞘磷脂和甘油磷脂的区别骨架甘油磷脂：甘油鞘磷脂：鞘氨醇碳氢链甘油磷脂：长度近似相等; 一条饱和，一条不饱和鞘磷脂：一长一短；两条都为饱和氢键甘油

4、磷脂：受体，只能用氢键形成3分子聚集体鞘磷脂：既可作受体，亦可作供体，可用氢键形成分子网络氢键受体氢键供体GPLSM15 糖脂 (glycolipid) 动物细胞中主要是鞘糖脂 由神经酰胺 (ceramide) 糖基 化形成 糖脂仅存在于质膜外表面 糖脂起信号识别的作用Gal = 半乳糖Glc = 葡萄糖GalNAc = 乙酰氨基半乳糖NANA = 唾液酸 唾液酸带负电，是细胞膜表面电荷的主要来源16Salic acid 唾液酸流感病毒用唾液酸作为入侵受体17 胆固醇 (cholesterol)18胆固醇的确切的生理功能还不十分清楚 !已知与生物膜的相行为，流动性，膜的分选与运输。 膜中胆固醇

5、含量与细胞老化(aging)有一定关联。 1920脂质分子的双亲性21脂质分子理化性质的意义脂质分子的双亲性决定了其在水中以聚集形式存在极性头部亲水-在水溶液中朝向水非极性尾部亲油-在水溶液中避开水并聚集脂质分子的形状决定其以何种方式聚集22Characteristics of Membrane生物膜的特性23膜的流动性24膜的不对称性25膜脂内外分布的不对称性脂的类型内侧外侧鞘磷脂1783磷脂酰胆碱2674磷脂酰乙醇胺7723磷脂酰丝氨酸955糖脂59526膜蛋白内外分布的不对称性27Figure 冷冻断裂电镜技术显示的脂双层及膜蛋白分布的不对称性 28Membrane Proteins膜蛋

6、白29膜蛋白 (membrane protein)膜蛋白是膜功能的载体物质输运- 载体 （糖转运蛋白），通道（K+通道），离子泵（Na+/K+-ATP酶）信号转导- 受体 （G-蛋白偶联受体），酶（磷脂酶C）能量转换- 酶（ATP合成酶），电子传递蛋白（细胞色素C）细胞识别- 糖蛋白 (glycoproteins)30内在膜蛋白(integral membrane proteins)是整合于膜上的蛋白质，总是与膜结合在一起。包括： 跨膜蛋白 (transmembrane protein)，顾名思义即跨越膜的两端的蛋白质。单向及多向内在膜蛋白 (single-pass and multi-pas

7、s membrane protein) 31外周膜蛋白是能够暂时与膜结合的蛋白质(Peripheral membrane proteins)这种结合可以通过加入极性试剂，如高pH或高盐溶液来破坏脂锚定蛋白 (例如GPI蛋白) 32Q: multipass and single-pass transmembrane proteins in this figure? 33膜蛋白镶嵌方式 GPI proteins34 Lipid-raft model (脂筏模型)脂筏是质膜上富含胆固醇和鞘磷脂的微结构域如同脂筏一样载着各种蛋白 35 研究膜蛋白结构的方法分子生物学 分子克隆 (molecular c

8、loning)- 一级结构定点突变 (site-directed mutagenesis)- 功能分子杂交 (molecular hybridization)- 鉴定蛋白家族36 研究膜蛋白结构的方法结构生物学二级结构预测 (secondary structure prediction)- 二级结构X-射线晶体学 (X-ray crystallography)- 三级及四级结构电子显微学 (electron microscopy)- 三级及四级结构372.3 膜蛋白的结构膜蛋白分为两大类内在蛋白 (integral protein)或 intrinsic protein外周蛋白 (periph

9、eral protein) 或 extrinsic protein外周膜蛋白与水溶性蛋白结构类似本节只介绍膜内在蛋白的结构38内在蛋白的种类-螺旋单次跨膜-螺旋多次跨膜-折叠桶-螺旋锚定蛋白39内在蛋白(integral membrane proteins)通过疏水相互作用与膜脂疏水区结合分子跨膜或镶嵌在膜内用去垢剂或？才能从膜上分离内在蛋白-酶-抗原-受体-载体-离子泵-离子通道40 内在蛋白如何跨膜脂双层的碳氢链是疏水的(hydrophobic)蛋白质必须减小极性，增强疏水性才能跨膜方式：形成分子内氢键并折叠-螺旋-折叠41The N-H of every peptide bond ish

10、ydrogen-bonded to the carbonyl group of the peptide bond 4 amino acids awayRibbon illustrationof -helixRibbon +C and NbackboneArrangementof atoms showing H bonds42 跨膜肽段的长度-螺旋的螺距为5.4 , 一周有3.6个氨基酸-螺旋中每个氨基酸的高度为 ? (=)脂双层疏水核的厚度为30跨膜约需? 个氨基酸(= ? ?)43 Antiparallel sheet (peptide chains runin opposite direc

11、tions) Peptide chains held together by hydrogen bonds between peptide bonds of adjacent peptide chains44 膜蛋白中-片层的跨膜肽键的极性通过形成氢键减弱侧链基团交替排列于片层两侧一侧以极性基团为主另一侧以非极性基团为主非极性侧向外与脂双层疏水烃链作用45 膜蛋白结构形式II- 片层桶46膜蛋白结构实例1-水通道细胞膜上有促进水通透的蛋白质-水通道(water channel)促进水的吸收与排泄水通道蛋白由 P.Agre 于1990发现水通道蛋白(AQP1)的三维结构由电子晶体学和X-射线晶体

12、学解出P.Agre 荣获2003年Nobel化学奖47 Agre的实验非洲爪蟾卵母细胞 4849水通道1（AQP1) 的三维结构 (Sui et al, Nature 414, 872, 2001)50 水通道的结构51 水通道的选择性 -为什么离子不能通过？通道的最狭窄处(constriction area)的直径为2.8H2O与周围基团形成氢键 可通过通道离子不能形成等效配位复合物 不能通过通道52 水通道的选择性 -为什么质子(H3O+)不能通过？通道的中央有带正电 的氨基酸静电排斥作用将带正 电荷的H3O+阻挡通道还含有带负电的 氨基酸静电排斥作用将带 负电的离子阻挡53膜蛋白结构实例

13、2- K+ Channel细胞膜上存在K+ Channel维持膜电位的稳定缺钾不仅精力和体力下降，心律失常，全身肌肉无力、懒动 结构由Rockefeller大学R.Mackinnon用 X-射线晶体学解析R.Mackinnon 荣获2003年 Nobel 生理医学奖54K+ Channel的分子结构分子生物学及电生理学实验表明K+ Channel是一个单一的多肽，由四个亚基组成每个亚基含6个跨膜螺旋 (S1-S6)S5与S6之间存在一个发夹区H5, 与形成选择性滤器有关S4带正电荷S6参与Channel的形成55 细菌K+ Channel细菌Streptomyces lividans 存在K+

14、通道KcsA, 由4个亚基构成每个亚基含2个-螺旋，相当于K+通道的螺旋5和6KcsA可用分子生物学方法大量表达, 为用X-射线晶体学解析结构奠定了基础56 细菌K+ Channel的三维结构 (Doyle et al, Science 280, 69,1998)57 细菌K+ Channel的三维结构58 K+ Channel的结构特点带负电的氨基酸集中于通道两端的入口与出口处一个环从pore helix伸向通道出口处， 形成选择性滤器 (selectivity filter), 并起到脱水作用由4个亚基构成的选择性滤器形成一个短而坚固的狭孔，孔的直径0.3nm一个笼子只能容纳一个钾离子选择

15、性滤器(笼子)由3个主链羰基构成59 K+ Channel的结构特点60 K+ Channel的选择性 -为什么阴离子不能通过？带负电的氨基酸（红色）集中于通道两端的入口和出口处静电场作用吸引阳离子 (cations)排斥阴离子 (anions)61CartoonPotassium ion channel62Na+离子和钾离子谁的半径大？Na+离子是否可以通过？63 K+ Channel的选择性 -Na+能否通过？一种流行观点：当离子进入选择性孔道时，必须脱水对K+而言，选择性孔道的大小合适K+与羰基作用，形成配位复合物对Na+ 而言，选择性孔道比Na+ 大Na+不能有效的与羰基作用Na+不能

16、有效脱水，无法通过滤器64离子与K+ Channel的相互作用65事实上，这种观点目前已经被证反，通道在极端条件下（钾离子完全不存在）是可以通透钠离子的。Nature Structural & Molecular Biology (17): 10191023, (2010)66 K+ Channel如何开关？形成selectivity filter的结构非常坚固 在通道开关过程中不发生构像变化跨膜螺旋在通道开关过程中发生构像变化, 控制底部的开启67细菌K+ Channel的开关机制 (Jiang et al, Nature 417, 523, 2002)红色：关闭状态；黑色：开放状态68 通

17、道开关的控制类似于照相机光圈的运动 通道并不完全关闭，形成通道的氨基酸侧链阻碍了离子通过 K+ Channel开关的模式图69负责“拧紧”通道闸口70膜蛋白结构实例3- ATP合成酶ATP合成酶 (ATP synthase)存在于线粒体内膜上利用跨膜质子电化学梯度驱动ATP合成结构由剑桥MRC分子生物学实验室J.Walker用X-射线晶体学解析J.Walker荣获1997年Nobel化学奖71 ATP 合成酶的构成F1- the catalytic subunit当将F1从膜上分离下来时，发现F1可催化 ATP 水解 Fo- a proton channel当把F1从膜上分离时，H+可从含F0

18、的膜中流出当把F1重新加回时，膜对H+的通透性降低到原来的水平F1F072 ATP合成酶的亚单位-F1大肠杆菌的F1 含5种多肽链 a3, b3, g, d, e a & b subunits 的氨基酸组成类似（homologous） 从膜平面看a & b subunits 交替排列，形成一个环73 ATP合成酶的结构模式线粒体大肠杆菌74 F1-ATPase的晶体结构 (Abrahams JP et al, Nature 370, 621, 1994) g subunit 在a & b subunits 环之间形成一个支柱shaft （Colours: a, b, g, d, e.）75真人

19、演示版？/v/b/45040948-1775147555.htmlEssential Cell Biology, 3rd Edition，199876Binding change mechanismPaul Boyer 提出：与Fo相连的不规则形状的亚单位相对于3个 subunits进行旋转旋转由流过Fo 的H+ 驱动旋转改变了3个 subunits的构象，驱动ATP合成77Binding change mechanism绿色亚单位按顺序在下列三种状态变化:松散 ( loose) 构象，活性部位松散的结合ADP + Pi 紧密 (tight）构象， 活性部位紧密结合底物并形成ATP开放 (open）构象， 形成的ATP从活性部位释放78 ATP合成酶工作机制 -Banding Change Mechanism79 ATP合成酶工作机制-Banding Change MechanismF1的晶体结构表明:三个催化亚基处于不同结合状态三个催化亚基处于不同构象状态结构与binding change model完全符合, Walker 与Boyer分享了1997 Nobel 化学奖80In vitro study of membrane protein 生物膜的离体研究81Methods for solubilization of membrane proteins超声波降解82 去