流式细胞仪基础知识介绍课件

1、1流式细胞仪基础知识介绍1流式细胞仪基础知识介绍1流式细胞仪基础知识介绍目录流式细胞仪的定义和分类流式样本的前处理流式细胞仪的结构和原理流式数据的获取和分析目录流式细胞仪的定义和分类流式样本的前处理流式细胞仪的结构和原理流式数据的获取和分析目录流式细胞仪的定义和分类流式样本的前处理流式细胞仪的结构和原理流式数据的获取和分析流式细胞仪的定义流式细胞术（flow cytometry , FCM）：是一种定量分析技术，是指利用流式细胞仪检测细胞特异性标记荧光信号而测定细胞的多种生物物理性质的方法，同时也是一项可以把具有某相同荧光信号特性的某些细胞亚群从多细胞群体中分离和富集出来的细胞分析技术。流式细

2、胞仪(flow cytometer)： 是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术和抗原抗体检测技术为一体的新型高科技仪器。 流式细胞仪的检测特点单细胞悬液或生物颗粒 分析速度高多参数精度高当代最先进的细胞定量分析技术光信号流式细胞仪的检测范围 检测范围：凡细胞内能进行荧光标记的成分或变化都可用流式细胞仪进行检测。RNA含量细胞大小细胞颗粒度细胞表面面积DNA含量与细胞周期蛋白质含量钙离子，PH值,膜电位细胞结构特异性抗原（细胞表面/胞浆/核）细胞内细胞因子细胞活性酶活性激素结合位点细胞受体细胞功能流式细胞仪的分类分析型 自动化程度高，操作简单，适用于临床使

3、用；分选型 分辨率高，多激光高配置，可将感兴趣的细胞分选出来，适用于科研使用；常见分析型流式细胞仪常见分选型流式细胞仪目录流式细胞仪的结构与原理流式样本的前处理流式细胞仪的定义和分类流式数据的获取和分析流式细胞仪的结构及原理液流系统液流驱动原理光学系统信号产生与收集原理电子系统信号检测原理液流系统主要作用：提供稳定的鞘流，将样本悬液聚焦在光束中心处以供检测； 主要部件：流动室（对于分选型也叫喷嘴）、管路、阀门样本流实现方式： 负压驱动样本流：BD ： FACSVerse、Acurri C6 ， Mindray ：BriCyte E6 正压实现样本流：BD ：FACSCanto、Calibur、

4、Aria， BCI ： FC500、Gallios 液流驱动原理鞘液流动室样本鞘液样本流进样针流动室主要作用：提供光源、产生并收集光信号主要部件：激光器、透镜、滤光片光学系统BriCyte E6仪器的光学系统图激光器 蓝光 488nm 红光 638nm 紫光 405nm 紫外光 355nm 绿光 532nm （注：根据其激发波长区分）信号产生要素之一信号产生要素之二荧光素 常见荧光素及其激发激光器信号产生要素之三荧光染色荧光素角色荧光标记荧光素荧光素抗体携带抗原的细胞信号产生原理滤光片长通滤片短通滤片带通滤片波长大于特定功能的光可以通过，波长小于该波长的光被反射波长小于特定功能的光可以通过，波

5、长大于该波长的光被反射波长在某特定范围内的光可以通过，波长在该范围以外的光被反射480535580480535580530长通530短通530/30带通480535580信号收集原理-滤光片 主要作用：接收、处理光信号；将光信号转变为电信号，再将电信号数字化；主要部件：光电二极管（PD)、光电倍增管（PMT）、信号处理板电子系统信号检测原理信号检测器光电二极管无电流放大作用信噪低光电倍增管（PMT）电流放大倍数可达106信噪比较光电二极管高tv脉冲高度（H）脉冲宽度（W）脉冲面积（A）信号类型脉冲信号荧光侧向散射光前向散射光FSC检测器FSC检测器激光SSC检测器SSC检测器FL4FL6FL5

6、(PE-cy7)FL3(PerCP)FL2(PE)FL1(FITC)SS488/10530/30FS488/10585/40670LP785/60491/LP550LP645LP660/20785/60740LP反光镜tvFL6(APC-cy7)FL4(APC)反光镜tvtvtvtvtvtvtvFSCSSCFL1FL2FL3FL5流式细胞仪工作原理模拟图配置：激光器数目和荧光通道数目；灵敏度：能检测最小粒子的大小； 能检测细胞上最少的荧光分子的数量（MESF）；分辨率：衡量仪器测量精度的指标（CV）；分析速度：指每秒分析的粒子个数； 常用流式细胞仪术语目录流式样本的前处理流式细胞仪的结构域原理

7、流式细胞仪的定义和分类流式数据的获取和分析流式细胞仪实验流程全血抗凝血培养细胞新鲜组织石蜡包埋组织体液单细胞悬液荧光抗体标记上机检测酶消化法机械法化学处理法细胞膜抗原标记细胞浆抗原标记膜浆抗原同时标记单色标记多色标记目录流式数据的获取和分析流式细胞仪的结构域原理流式细胞仪的定义和分类流式样本的前处理流式细胞仪上机流程 开机建立模板仪器设置采集数据仪器质控流速停止条件电压阈值PD或PMT控制可由用户调节各通道互不干扰图像上目标细胞位置随电压变化实时更改调整原则：通常使目标细胞位于中央或靠近中央位置各通道均可设置单通道阈值设置多通道orand组合去除噪声及碎片低、中、高速低速样本流最稳定高速收集速

8、度最快时间体积粒子数特定目标细胞团在选定条件点自动停止测试仪器设置用户可通过PC端软件进行以下条件的设置，并可直观观察到变化，从而获得满意的结果。主要作用：数据分析、显示主要部件：电脑工作站数据分析要素图门数据统计图类型直方图散点图等高线图密度图三维立体图图坐标轴显示线性坐标：将数据均匀的映射到各个像素点；一般用于显示FSC和SSC数据对数坐标：数据做对数变换后均匀的映射到各个像素点 可以将大数据在坐标轴上压缩，小数据在坐标轴上拉伸 可用于阳性标定范围广、但阴性标定信号低，线性坐标不易于分辨的情况双指数坐标：数据做双指数变换后均匀的映射到各个像素点 双指数可解决对数坐标表示时小的部分过于放大及无法显示负数的问题线性对数双指数 设门：在细胞分布图中确定一个范围，对感兴趣的细胞进行单参数或多参数析，获得门内细胞的百分比等参数门不规则门&十字门区间门&二分门细胞百分比、绝对值均值、标准差、CV结果以何种形式呈现统计参数FITC530/30PE585/40数据分析荧光补偿+FITC通道信号=PE通道信号=实测实测真实真实 流式细胞仪上