抗原致敏树突状细胞诱导CIK对胃癌细胞杀伤作用的研究

1、抗原致敏树突状细胞诱导CIK对胃癌细胞杀伤作用的研究胡廷辉应敏刚郑秋红龚福生谢云青树突状细胞dendritiell，D是成效最强的抗原呈递细胞，是机体T淋巴细胞特异免疫应答的直接启动和调控者，在机体的抗肿瘤免疫应答中发挥着紧张作用。在体外造就D并用肿瘤抗原致敏后，携带肿瘤抗原信息的D，在体表里激活针对该肿瘤细胞的特异性杀伤细胞。本试验在体外用人胃癌细胞SG提取肿瘤抗原致敏D后诱导IK，通过其对SG的杀伤作用的研究为D治疗胃癌的研究提供理论及试验根据。1质料与要领1.1重要试剂SG由福建省肿瘤病院分子生物学研究室提供；rhIL?鄄2、rhIL?鄄4、D3Ab购自Peprteh公司；rhG?鄄SF

2、、Fill淋巴细胞分散液购自军事医学科学院；胎牛血清(超等)购自杭州四序青生物成品公司；人AB血清由福建省血液中央提供；1640造就基购自Gib公司；FIT标识表记标帜的小鼠抗人D83、HLA?鄄DR、D14、D86及同亚型比拟抗体购于晶美生物工程。1.2要领SG在52、37条件下，用含有10胎牛血清RPI1640造就液通例造就。将造就贴壁肿瘤细胞用胰酶消化悬浮，离心弃上清，用无血清RPI1640造就液重悬，超声破膜，30000r/in超速离心90in，取上清。浓缩透析，调解卵白浓度为25g/l，经0.22滤膜滤过除菌，80保存。无菌条件下网罗的正凡人抗凝外全面血，经淋巴细胞分散液梯度离心，猎

3、取单个核细胞，用含10%AB血清的RPI1640悬浮细胞，调解细胞浓度至5107/l，加1l至6孔板内造就箱中造就2h，吸掉上清，用造就液洗去非黏附细胞，得到贴壁细胞，每孔再参加3l含有rhIL?鄄4500U/l及rhG?鄄SF500g/l的10%AB血清的RPI1640造就液，23d半量换液1次。将上述造就5d的D用含有rhIL?鄄4500U/l及rhG?鄄SF500g/l的10%AB血清的RPI1640造就液调解细胞浓度为1106/l，向6孔板内参加2l的细胞，每孔参加肿瘤细胞总卵白1l25g，于第8d网络悬浮细胞为抗原致敏的D。比拟组参加无血清RPI1640造就液1l，于第8d网络悬浮细

4、胞为空缺的D。别离网络第1d、第5d及第8d抗原致敏的D，用流式细胞仪检测D外貌分子HLA?鄄DR、D83、D86、D14表达。同前法从外周血中猎取单个核细胞，用含10%AB血清的RPI1640悬浮细胞，37、5%2造就箱中造就2h，取悬浮细胞，调解细胞数为1106/l，用含有IL?鄄2(250U/l)、D3Ab(50g/L)的10%AB血清的RPI1640造就液造就，23d半量换液1次至第8d。试验组用将其别离与空缺的D及抗原致敏的D按10：1比例相混，用含有IL?鄄2(250U/l)、D3Ab(50g/L)的10%AB血清的RPI1640造就液在6孔板内造就。比拟组仅用含有IL?鄄2(25

5、0U/l)、D3Ab(50g/L)的10%AB血清的RPI1640造就液在6孔板内造就。5d后别离猎取抗原致敏D诱导IK，空缺的D诱导IK及IK为效应细胞。试验组网络成熟经抗原致敏及空缺的D，用含有IL?鄄2(250U/l)、D3Ab(50g/L)10%AB血清的RPI1640调解细胞数为1106/l。网络同时期造就的TK用同样的造就液调解细胞数为1107/l。将100lIK别离与100l经抗原致敏及空缺的D在96孔造就板中混淆造就。比拟组100lIK参加100l含有IL?鄄2(250U/l)、D3Ab50g/L10%AB血清的RPI1640继承造就。72h后参加四甲基偶氮唑蓝TT10g，继承

6、造就4h，离心弃去孔内上清，每孔参加150l二甲基亚砜DS震荡10in，待结晶物充实溶解，用酶标仪在570n处测D值A，每组设3个复孔，取均值按下式盘算：刺激指数SI=A实行孔/A比拟孔100用TT比色法测定抗原致敏D诱导IK，空缺的D诱导IK及IK对SG细胞的杀伤活性，效靶比为5：1、10：1、20：1。调解细胞至所需浓度，各取100l的效靶细胞悬液参加96孔板中，于37、5%2造就箱中造就24h后，参加四甲基偶氮唑蓝TT10g，继承造就4h，离心弃上清，每孔参加150l二甲基亚砜DS震荡10in，待结晶物充实溶解，用酶标仪在570n处测D值，同时设空缺比拟、靶细胞比拟、效应细胞比拟。每孔设

7、3个复孔，取其均值按下式盘算：IK细胞毒性1A效+靶A效/A靶100%1.3统计学要领接纳SPSS10.0软件对数据举行析因阐发及t查验。2效果2.1D形态学的不雅察从外周血得到单个核细胞，造就2h，得到贴壁细胞，多为体积孝圆形的单个核细胞。5d时可见细胞舒展体积变大，外形不规矩，部门细胞悬福经抗原致敏后第8d时可见大部门细胞悬浮，变大并伸出伪足，细胞内可见大量的颗粒，倒置相差显微镜下可见毛刺状突起，为典范D形态。2.2抗原负载前后D表型的变革用流式细胞仪检测D外貌分子HLA?鄄DR的表达第1d为5.01、第5d为28.21、第8d为62.01。D83别离为1.03、4.50、15.57。D8

8、6别离为4.47、25.75、41.03。D14别离为13.02、3.26、0.55。2.3混淆淋巴细胞反响2.4细胞杀伤试验用TT比色法测定抗原致敏D诱导IK抗原?鄄D?鄄IK，空缺的D诱导IK空缺?鄄D?鄄IK及IK对SG细胞的杀伤活性表1。析因阐发效果表现：差异因素诱导IK对胃癌细胞SG杀伤作用差异，抗原致敏D诱导IK对该肿瘤细胞杀伤作用最强P0.01，提示抗原致敏D诱导IK对该肿瘤细胞有特异性的杀伤作用。差异效靶比之间杀伤作用差异P0.01，效果比力表现效靶比越高，杀伤作用越强。IK与效靶比之间有交互作用，此中抗原致敏D诱导IK在效靶比为20：1时杀伤作用较别的各组强。但空缺的D诱导I

9、K与IK两组之间阐发效果表现两组杀伤作用差异有无明显性意义P0.05，提示空缺的D诱导IK对SG无特异性杀伤作用。结合混淆淋巴细胞反响效果提示，抗原致敏D诱导IK可通过激活对该肿瘤有特异性杀伤作用的淋巴细胞及促进淋巴细胞增殖两方面可明显性进步IK对肿瘤的细胞杀伤作用。3讨论D在体外的致敏与其在体内发育历程相似，履历未成熟与成熟两个阶段。未成熟D泉源于外周血或骨髓中的单个核细胞，经IL?鄄4及G?鄄SF诱导形成3。本研究亦用此要领得到D。体外诱导D成熟有抗原负载、细胞因子和佐剂刺激等要领。本研究从人胃癌细胞系SG经超声破膜猎取含有多种肿瘤抗原的肿瘤总卵白，用其致敏D，显微镜下可不雅察到致敏的D细

10、胞呈典范成熟D的形态。用流式细胞仪检测D外貌分子效果表现,接纳SG抗原负载的D，代表D成熟的外貌分子HLA?鄄DR、D83、D86升高，代表单个核细胞外貌分子D14落落，说明经SG肿瘤细胞抗原负载可诱导D成熟。肿瘤细胞总卵白中包罗有富厚的膜抗原、H类和类抗原表位、多种热休克卵白分子等身分，颠末D的摄娶加工和呈递后，可引发针对多种肿瘤抗原簇的克隆4；可诱导针对该抗原的特异性细胞毒性T淋巴细胞，发挥有用的抗肿瘤免疫效应5。IK细胞除了具有NK细胞非H限定的杀瘤作用，还具有T细胞的抗瘤作用。因此用抗原致敏的D诱导IK细胞，与未经抗原致敏的D诱导IK细胞及IK细胞比拟，对雷同抗原靶细胞具有更强的杀伤作

11、用。本研究中TT试验的效果证明经抗原致敏的D诱导IK细胞的杀瘤作用较未经抗原致敏的D诱导IK细胞及IK细胞杀瘤作用强。虞积仁等6也证明，抗原致敏的D诱导细胞仅对带有雷同抗原的靶细胞有特异性杀伤。而空缺D诱导IK细胞与细胞因子诱导IK缺乏特异性，两者之间杀伤试验无显着差异。张宏文等7研究亦创造同样效果。混淆淋巴细胞反响效果表现D与IK混淆造就72h后，视野中D细胞消散与成熟D在完成抗原呈递后凋亡有关8。空缺的D与抗原致敏的D，两者均能显着促进IK增殖，但两者之间差异无明显性意义，张嵩等9亦有雷同的报道。说明成熟D促进IK增殖与有无抗原负载无关，大概与成熟D高表达种种黏附分子与IK外貌的受体结合促

12、进IK细胞的增殖有关。本研究通过对人肿瘤细胞系SG提取肿瘤抗原致敏D诱导IK杀伤成效的试验研究，证明抗原致敏D诱导IK可通过诱导特异性IK细胞及促进IK细胞增殖两方面明显进步IK细胞的杀瘤效应，为进一步的临床试验研究提供试验根据。【参考文献】1郑秋红,郑天荣,卢林,等.人外周血树突细胞的分散与提纯J.福建医科大学学报,2000,34(2):115118.2郑秋红,郑天荣,谢云青,等.树突状细胞对自体IK细胞体外杀伤肺腺癌细胞影响的研究J.肿瘤防治杂志,2022,12(16):384-387.3rseE,ZhuLJ,TedderTF,etal.Generatinfdendritellsinvit

13、rfrperipheralbldnnulearellsithgranulyte?鄄arphage?鄄lny?鄄stiulatinfatr,interlekin?鄄4,andturnersisfatr?鄄alphafruseinaneriuntherapyJ.AnnSurg,1997,266(1):6-16.4古涛,朱一蓓,李敏,等.肿瘤细胞冻融裂解物上清对凋亡细胞负载的树突状细胞生物学特性的作用研究J.中国病理生理杂志,2022,19(3):301-305.5VuillierF,aluK,ThasEK,etal.Iditype?鄄pulseddendritiellsareabletindueantigen?鄄speifiTL?鄄ediatedprtetiveturiunityJ.BrJHaeatl,2022,120(2):243-250.6虞积仁,石永进,岑溪南,等.细胞因子诱导杀伤细胞与抗原特异性细胞因子诱导杀伤细胞杀伤肿瘤效应比力的实行研究J.北京大学学报(医学版),2022,35(2):141-142.7张宏文,彭晓,张晓燕.