抗原抗体知识

1、抗原抗体知识抗原(antigen, Ag)抗原的概念:凡是在机体内引起体液免疫和(或)细胞免疫反应的物质，称为抗 原。抗原具有两个方面的特性：-免疫原性:引起机体产生抗体和(或)致敏淋细胞的特性；-免疫反应性:抗原能与相应的抗体及致敏淋巴细胞发生特异的结合或反应的 特性。根据抗原是否显示免疫原性分为：-完全抗原:分子量较大，一般在10kDa以上,并具有较复杂的化学组成。免 疫原性最强的是蛋白质抗原,多糖次之；脂类和核酸必需和蛋白质及多糖形成复合 物才具有良好的免疫原性。-半抗原:又称为不完全抗原，分子量较小。例如:某些短肽、多糖、类脂和药物 等。半抗原必需与载体结合,才能获得免疫原性。载体通常

2、是具有高度免疫原性的大分子物质,具有将免疫原性传递给偶联的半抗 原能力。-常用的载体有钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin, KLH)、牛血清 白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、卵白蛋白(Ovalbumin, OVA)等。-用戊二醛或碳化二亚胺作为交联剂通过功能基团-NH2、-COOH等将半抗 原结合到载体上。结合比例为5kDa结合525个分子的小肽。(三)抗体(antibody, Ab)1、抗体的概念:.机体受到抗原刺激后，由浆细胞合成并分泌出一类具有与抗原发生特异性结 合的球蛋白,被称为抗体。-抗体主要存在于血清内；-抗体都是免疫球蛋

3、白,但免疫球蛋白并不一定都是抗体。-免疫球蛋白根据重链的结构及抗原特异性不同分为五种，既IgG、IgD、 IgE、IgA、IgM。2、免疫组化实验中常用的抗体:单克隆抗体和多克隆抗体。“单克隆抗体:是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，是应用细胞融合杂交瘤技术 免疫动物制备的。-特异性强、抗体产量高。“多克隆抗体:是将纯化后的抗原直接免疫动物后,从动物血中所获得的免疫血 清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。-特异性低，会产生抗体的交叉反应。-多克隆抗体广泛应用于石蜡包埋组织切片，可减少假阴性染色机会。-抗原与抗体的结合,要求量保持一定比例，当抗原或抗体过量时,是不能聚合 成大颗粒。3、抗体的

4、制备一一多克隆抗体的制备动物的选择佐剂（adjuvant）免疫方法免疫剂量抗体效价的测定放血或定期抽血（1）动物的选择选择什么动物来免疫取决于：所需抗血清的量-小鼠只能提供1.01.5ml的血液而山羊能提供几升。能供免疫用的抗原量-小鼠50mg足够，而山羊需要几毫克。（1）动物的选择（续）动物的品系:免疫动物与提供抗原的动物之间的种系差异越大越好。-例如哺乳动物的抗原可选择非哺乳动物来制备抗体。-常用的动物有兔、羊、马、猪等，以兔（新西兰兔，年轻，健壮，体重在2.5kg左 右，雄性）为最常用。（2）佐剂（adjuvant）般可溶性抗原注射后,迅速从注射部位扩散、吸收代谢。佐剂可延长潴留 时间,

5、且延长免疫刺激作用。因此在制备抗体的过程中，常将抗原和佐剂一起注 射最常用的佐剂是弗氏佐剂,又分为:-弗氏不完全佐剂（Freunds incomplete adjuvant）-弗氏完全佐剂（Freunds complete adjuvant）弗氏不完全佐剂（Freunds incomplete adjuvant, FIA）是由油剂（石蜡油或植物油）与乳化剂（羊毛脂或Tween80）混合而成,比例 为1:1、2:1、3:1或5:1,可根据需要而定，通常2:1。使用时与水溶性抗原按1:1比例充分混合,使抗原分散在佐剂中形成油包水 乳剂。弗氏完全佐剂（Freunds complete adjuvan

6、t, FCA）在弗氏不完全佐剂中加入活卡介苗或死的结核分枝杆菌（终浓度为2 20mg/ml）,即成为 FCA。免疫动物时，将弗氏佐剂与抗原按体积1:1混合乳化后（油包水）注入动物。 -般首次注射时用完全佐剂乳化,第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐 剂。佐剂与抗原乳化的方法研磨法:适于制备大量的佐剂抗原-先将不完全佐剂加热，取1.73ml放人无菌玻璃研钵内;缓缓滴入0.23ml活 卡介苗，边滴边按同一方向研磨，使菌体完全分散。-按同样方法滴人抗原，每加一滴应研磨至小滴消失。滴加抗原的速度要慢， 待抗原全部加人后,应成为乳白色粘稠的油包水乳剂。缺点:研钵壁上粘附大量乳剂,抗原损失较大，对微量

7、或难得抗原不宜采用。佐 剂与抗原乳化的方法（续）.注射器混合法-将等量的完全佐剂和抗原分别吸人两个5ml注射器内，然后插入三通管内，交 替推动针管混匀，往复操作直至形成粘稠的乳剂为止。优点:无菌操作,节省抗原或佐剂。缺点:不易乳化，时间长。佐剂与抗原乳化的方法（续）.快速乳化法利用超声波粉碎器可快速乳化抗原和佐剂混合物。-将抗原和佐剂按所需量加入一离心管中,置于超声波粉碎器上,粉碎头浸入液 面下0.5cm，离瓶底0.5cm左右，以免打碎离心管。-每次乳化1015s，然后置冰箱lmin左右。反复乳化34次即可完全乳 化。管内残余量800r/min离心510min收集。优点:简单、快速、节省材料。

8、乳化剂的鉴定判断乳化是否充分,可将一滴乳化好的液体滴在水面上(冷水中)，如能长时间 保持圆珠形而不散开,表示乳化达到要求。免疫方法免疫途径.常有静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内、淋巴结、脚掌等注射。般采用多点注射方法-常在足、掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等处的皮内或皮下。-皮内易引起细胞免疫反应，有利于提高抗体的效价。(3)免疫方法免疫途径(续)几点说明：-大动物一般不用腹腔注射-颗粒抗原和使用佐剂时不能静脉注射-抗原宝贵可采用淋巴结内微量注射法，只需10100mg抗原即可获得较好的 免疫效果。-皮内注射较困难，特别是天冷时更难注入。(3)免疫方法次数及间隔时间次数一般为23次(初次免

9、疫和加强免疫)-首次注射后,1015天再加强注射；-剂量同首次或为首次的一半，用不全佐剂或不用佐剂。.间隔时间，一般而言，动物越大，间隔越长-豚鼠、大鼠为78天兔子为1015天羊为1428天；-第三次注射的间隔时间更长些，效果更好。举例1：家兔的免疫初次免疫-用50200mg Ag加入FCA在背部皮下注射68点每点0.10.2ml也 可肌肉内或皮内注射；两周后，加强免疫-将50200mg Ag于PBS或FIA中,在肌肉、皮下、静脉或腹腔内注射; 抗体效价的检测:加强免疫一周后,耳缘静脉采血-抗体效价测定可用环状沉淀试验、琼脂双向扩散法等方法。前者抗体效价在 1:4000以上，后者在1:16以上

10、，即可采血,取血清进一步提纯。举例2:微量抗原淋巴结内注射免疫家兔般选择2.53.0kg的新西兰种公兔-先在其两脚垫注射完全福氏佐剂0.2ml （卡介苗每兔合5mg）;-10天后，见胭窝淋巴结肿大，然后将抗原注射至肿大的淋巴结内，第一次注射 抗原用完全福氏佐剂混合乳化；-以后每隔20天用不完全福氏佐剂乳化抗原，以同样方法加强2次，各次注射 的抗原均为2550mg ；-末次注射两周后兔耳放血测价（可达1:128）。举例3:豚鼠和大鼠的免疫初次免疫-用10100mg Ag加入FCA，在背部皮内注射46点每点0.lml，也可肌 肉内或皮下注射;.加强免疫-每隔78天将1050mg Ag于PBS或FIA中。在肌肉、皮下或静脉注 射；抗体效价的检测（4）免疫剂量抗原性强的抗原量应小，过大反会引起免疫抑制；免疫周期长的动物可少量多次注射，短的可