拟南芥原生质体制备转化方法整理

1、溶液配制1、纤维素酶解液:试剂15ml酶液体系11-1.5% Cellulase R10 (YaKult Honsha)0.225g干粉20.2-0.4% Mecerozyme R10 (YaKultHonsha)0.045g十粉30.4M mannitol1.09g十粉420mM KCl1 ml 0.3 M KCl 母液520mM MES,pH5.71 ml 0.3 M MES,pH5.7 母液6加入10ml水755C水浴加热10分钟，冷却全室温后加入以下试剂810mM CaCl1 ml 0.15M CaCl290.1 % BSA1 ml 1.5%BSA (4C保存)105 mM p -Me

2、rcaptoethanol1ml 75mMp -Mercaptoethanol 母液11用0.45p m滤膜过滤后使用过滤2、PEG4000溶液（一次配置可以保存五天，但是最好现用现配，每个样品需O0WPEG4000溶液，可根据实验样品量调整溶液配置总量）PEG40001g水0.75ml0.8 Mannitol0.625ml1 M CaC!20.25ml约 1.2ml3、W5溶液W5 (1000ml)154mM NaClNaCl9g125mM CaCl2CaCl2 H2O18.4g5mM KClKCl0.37g5 mM glucoseglucose0.9g0.03% MESMES0.3gpH

3、to 5.8 with KOH,高温高压灭菌20分钟，室温保存。4、MMG溶液MaMg 溶液(500ml)15mM MgCl2MgCl0.71g0.1%MESMES0.5g0.4 M mannitolMannitol36.5g用KOH调pH 5.6，高温高压灭菌20分钟，室温保存。5、WI溶液WI(200ml)0.5M mannitolmannitol18.217g4mM MES,pH5.7MES0.3g20mM KClKCl0.12g高温高压灭菌，室温保存。拟南芥原生质体制备转化方法整理一、土培室播种种植的拟南芥。二、生长良好情况下在未开花前用于取材叶片制备原生质体。三、剪取中部生长良好的叶

4、片用刀片切成0.5 -1 mm宽的叶条。四、将切好叶条掷入预先配置好的酶解液中（每5-10 ml酶解液大约需10-20 片叶子）。并用镊子帮助使叶子完全浸入酶解液。五、用真空泵于黑暗中抽30分钟。（此时可配制PEG4000溶液，200和1000 ul 枪头去尖使操作时吸打缓和。）六、在室温中无须摇动继续黑暗条件下酶解至少3个小时。当酶解液变绿时轻轻摇晃培养皿促使原生质体释放出来。（此时预冷一定量W5溶液）七、显微镜下检查溶液中的原生质体，拟南芥叶肉原生质体大小大约30-50 um。八、在过滤除去未溶解的叶片前用等量的W5溶液稀释含有原生质体的酶液。九、先用W5溶液润湿35-75 um的尼龙膜或

5、60-100目筛子，然后用它过滤含有 原生质体的酶解液。十、用30毫升的圆底离心管100g，1-2分钟离心沉淀原生质体。尽量去除上清 然后用10ml冰上预冷的W5溶液轻柔重悬原生质体。卜一、在冰上静至原生质体30分钟。以下操作在室温23。下进行 十二、100g离心八至十分钟使原生质体沉淀在管底。在不碰触原生质体沉淀的 情况下尽量去除W5溶液。然后用适量MMG溶液（1m）重悬原生质体，使之最终 浓度在2X105个/ml。十三、加入10 ul DNA（10-20微克约5-10kb的质粒DNA）至2ml离心管中。十四、加入100 ul原生质体（2x104个），轻柔混合。十五、加入110 ul PEG溶液，轻柔拍打离心管完全混合（每次大约可以转化6-10 个样品）。十六、诱导转化混合物5-15分钟（转化时间视实验情况而定，要表达量更高也 许需要更高转化时间）。十七、室温下用400-440 ul W5溶液稀释转化混合液，然后轻柔颠倒摇动离心管 使之混合完好以终止转化反应。十八、室温下用台式离心机100g离心2分钟然后去除上清。再加入1ml W5溶液 悬浮清洗一次，100g离心两分钟去上清。十九、用1ml WI溶