土壤微生物量测定方法(共6页)

1、PAGE PAGE 7土壤(trng)微生物量测定方法一、土壤微生物生物量碳（氯仿(l fn)熏蒸K2SO4提取(tq)-碳分析仪器法）试剂（1）去乙醇氯仿制备：在通风橱中，将分析纯氯仿与蒸馏水按1 2（v : v）加入分液漏斗中，充分摇动1 min，慢慢放出底层氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。得到的无乙醇氯仿中加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。纯化后的氯仿置于试剂瓶中，在低温（4）、黑暗状态下保存。（2）氢氧化钠溶液c（NaOH）= 1 mol L-1：通常分析纯固体氢氧化钠中含有碳酸钠，与酸作用时生成二氧化碳，从而影响滴定终点判断和测定的准确度。配制时应先除去碳酸钠，根据碳酸钠不溶于浓碱，可

2、先将氢氧化钠配成50%（w : v）的浓氧溶液，密闭放置34 d。待碳酸钠沉降后，取56 ml 50%氢氧化钠上清液（约19 mol L-1），用新煮沸冷却的除去二氧化碳的蒸馏水释稀到1 L，即为浓度1 mol L-1 NaOH溶液，用橡皮塞密闭保存。（3）硫酸钾提取剂c（K2SO4）= 0.5 mol L-1：取1742.5 g分析纯硫酸钾，用研钵磨成粉末状，倒于25 L塑料桶中，加蒸馏水至20 L，盖紧螺旋盖置于摇床（150 r min-1）上溶解24 h即可。（4）六偏磷酸钠溶液（Na）= 5 g 100 ml-1，pH 2.0：称取50.0 g分析纯六偏磷酸钠溶于800 ml高纯度去离

3、子水中，用分析纯浓磷酸调节至pH 2.0，用高纯度去离子水定容至1 L。要注意的是六偏磷酸钠溶解速度很慢应提前配制；由于其易粘于烧杯底部，若加热常因受热不均使烧杯破裂。（5）过硫酸钾溶液（K2S2O8）= 2 g 100 ml-1：称取20.0 g分析纯过硫酸钾，溶于高纯度去离子水中，定容至1 L。值得注意过硫酸钾溶液易被氧化，应避光存放且最多使用7 d。（6）磷酸溶液（H3PO4）= 21 g 100 ml-1：量取37 ml 分析纯浓磷酸（85%），慢慢加入到188 ml高纯度去离子水中即可。（7）邻苯二甲酸氢钾标准溶液（）= 1000 mg C L-1）：取2.1254 g经105烘23

4、 h的分析纯邻苯二甲酸氢钾，溶于高纯度去离子水，定容至1 L。2、仪器设备碳自动分析仪（Phoenix 8000）、容量瓶（100 ml）、振荡器（300 r min-1）、可调加液器（50 ml）、可调移液器（5 ml）、烧杯（盛滤液用）（50100 ml）、聚乙烯提取瓶（100，150 ml），聚乙烯塑料桶（20 L，带螺旋盖），三角瓶（150 ml）、其它常规仪器。3、操作步骤（1）土样前处理新鲜土壤应立即处理(chl)或保存于4冰箱中，测定前先仔细除去土样中可见植物残体（如根、茎和叶）及土壤动物（如蚯蚓(qi yn)等），过筛（孔径 2 mm），彻底混匀。如果土壤(trng)过湿，应在

5、室内适当风干，以手感湿润疏松但不结块为宜（约为饱和持水量的40%）。如果土壤过于干燥，用蒸馏水调节至饱和持水量的40%。将土壤置于密封的大塑料桶内在25条件下预培养715 d，桶内有适量水以保持相对湿度为100%，并在桶内放一小杯1 mol L-1 NaOH溶液以吸收土壤呼吸产生的CO2。经过预培养的土壤应立即分析。如需保留，应放置于4的冷藏箱中，下次使用前需要在上述条件下至少培养24 h。这些过程是为了消除土壤水分限制对微生物的影响，以及植物残体对测定的干扰。土壤饱和持水量按Shaw（1958）的方法测定：在圆型漏斗下端装一带夹子的橡皮管，漏斗内塞玻璃纤维。取50 g土壤于漏斗中，夹紧橡皮管

6、，加入50 ml水保持30 min。然后打开夹子，测定30 min内流出的水量。加入的水量减去流出的水量，再加上原来土壤中含有的水量，即为该土壤的饱和持水量，以烘干土壤质量百分数表示。（2）熏蒸称取经前处理后相当于20.0 g烘干基重的新鲜土壤(25.0g)3份于50 ml烧杯中。将烧杯放入真空干燥器中，同时放入盛有去乙醇氯仿（约2/3烧杯）的烧杯23个，烧杯内放入少量经浓硫酸处理洗涤后烘干的瓷片（0.5 mm大小，防瀑沸），干燥器底部加入少量水以保持湿度。用土壤熏蒸抽真空装置抽真空，在0.07 MPa真空度下使氯仿剧烈沸腾35 min。关闭真空干燥器阀门，移置25黑暗条件下熏蒸24 h。将熏

7、蒸过的土壤转移到另一个干净的真空干燥器中，反复抽真空（0.07 MPa）6次，每次3 min，彻底除去土壤中的氯仿，直到无氯仿味为止。否则，残留在土壤中的氯仿将影响分析结果。熏蒸的同时，另称取等量的土壤3份，置于另一干燥器中，除不加入去乙醇氯仿进行熏蒸外，其他操作与熏蒸土壤一样，作为“对照”土壤。（3）提取将熏蒸土壤无损地转移到125 ml聚乙烯提取瓶中，加入80 ml 0.5 mol L-1K2SO4，土水比为1 : 4（w : v），振荡（25，300 r min-1）浸提30 min，用中速定量滤纸过滤于125 ml塑料瓶中。在熏蒸开始的同时，另称取等量的3份不熏蒸土壤于125 ml聚乙

8、烯提取瓶中，加入80 ml 0.5 mol L-1K2SO4同上浸提。同时做3个不加土壤的试剂空白。浸提液应立即分析，或在18下保存。要注意的是低温（18）下保存的土壤浸提液解冻后会出现一些白色沉淀，据推测为CaSO4和K2SO4，对浸提液中有机碳测定没有影响，可不必除去这些白色沉淀（Brookes等，1985），但解冻后也应立即测定，且在取样前应将浸提液彻底混匀。（4）测定取10 ml土壤(trng)提取液于40 ml样品瓶中（注意解冻的浸提(jn t)液在取样前应彻底混匀），加入10 ml六偏磷酸钠溶液（pH 2.0），使提取液中的沉淀(chndin)（CaSO4和K2SO4）全部溶解。采

9、用Phoenix 8000碳自动分析仪测定样液中的有机碳含量。先采用2 mm细管向样液中通入高纯度氮气510 min，先除去溶解在样液中的部分CO2，样液再进入无机碳排除管进一步排除残留的CO2。再进入紫外氧化室，在过硫酸钾溶液和磷酸溶液作用下样液中的有机碳全部氧化为CO2，产生的CO2经纯化后再通过红外检测器测定。详细操作步骤参见仪器使用说明。标准碳工作曲线：分别吸取0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 ml浓度为1000 mg C L-1邻苯二甲酸氢钾标准溶液于100 ml容量瓶中，用高纯度去离子水定容。即得到0、20、40、60、80、100 mg C L-1系列标准碳溶液。分别

10、吸取上述不同浓度度的标准碳溶液10 ml于40 ml样品瓶中，按上述相同方法测定。（5）结果计算：土壤微生物量碳：BC = EC / kEC式中：EC = 熏蒸土壤提取的有机碳 不熏蒸土壤提取的有机碳 kEC为转换系数，取值0.45。二、土壤微生物生物量氮（氯仿熏蒸K2SO4提取-流动注射氮分析仪器法）1、试剂（1）去乙醇氯仿制备：同上（2）硫酸钾提取剂c（K2SO4）= 0.5 mol L-1：同上（3）硫酸铬钾还原剂：称取50.0 g分析纯硫酸铬钾KGrSO42，溶于200 ml分析纯浓硫酸，用蒸馏水稀释到1 L。（4）硫酸铜溶液c（CuSO4）= 0.19 mol L-1：称取30.32

11、4 g分析纯硫酸铜（CuSO4）溶于蒸馏水并定容至1 L。（5）氢氧化钠溶液c（NaOH）= 10 mol L-1：称取400 g分析纯氢氧化钠溶于蒸馏水并定容至1 L。（6）氢氧化钠溶液c（NaOH）= 4 mol L-1：称取160 g分析纯氢氧化钠溶于双蒸水并定容至1 L，使用前用真空抽滤瓶（膜孔径0.45m）过滤。（7）氢氧化钠溶液c（NaOH）= 0.01 mol L-1：取2.5 ml 4 mol L-1 NaOH用去离子水稀释至1 L。（8）硼酸溶液（H3BO4）= 2 g 100 ml-1）：称取20.0 g分析纯硼酸（H3BO4）溶于蒸馏水定容至1 L。（9）硫酸溶液c（H2

12、SO4）= 0.05 mol L-1：取28.8 ml分析纯浓硫酸（H2SO4，= 1.84 g ml-1）用蒸馏水稀释到1 L，此溶液H2SO4浓度为0.5 mol L-1，将该溶液稀释10倍即可得到0.05 mol L-1硫酸溶液。再用0.1 mol L-1标准硼砂溶液标定其准确浓度。（10）标准硼砂溶液c（Na2B4O710H2O）= 0.1 mol L-1：先将分析纯硼砂（Na2B4O7 10H2O）在55蒸馏水中重结晶，过滤后得到的结晶放入装有食糖和氯化钠饱和溶液烧杯的干燥器中（相对湿度70%）干燥。准确称取经重结晶和干燥的硼砂38.13672 g，溶解于蒸馏水并定容至1 L。（11

13、）指示剂贮存(zhcn)液：称取1.0 g氨混合(hnh)指示剂溶解于10 ml 0.01 mol L-1 NaOH和10 ml 95%乙醇(y chn)混合液中，用去离子水定容至200 ml。该贮存液可存放1个月。（12）指示剂溶液：取10 ml指示剂贮存液用去离子水稀释并定容至500 ml，用真空抽滤瓶（膜孔径0.45 m）过滤。注意：此溶液应使用前一天配制，最多可使用1周。（13）标准氯化铵贮存液（NH4Cl）= 1000 g N ml-1：称取经105烘23小时的分析纯氯化铵3.8190 g溶于去离子水中并定容至1 L。此贮存液可稳定保存数月。（14）标准氯化铵溶液（NH4Cl）= 5

14、0 g N ml-1：取10 ml 1000 g N ml-1氯化铵用去离子水稀释至200 ml。此溶液最多保存7 d。2、仪器设备流动注射氮分析仪（FIAStar 5000，丹麦福斯公司）、真空抽滤瓶（膜孔径0.45m）、容量瓶（100 ml）、其他仪器设备同上。3、操作步骤（1）土壤前处理、熏蒸、提取同上。（2）提取液中硝态氮还原：吸取15.0 ml熏蒸与不熏蒸土壤0.5 mol L-1 K2SO4浸提液于250 ml消化管中，加入10 ml硫酸铬钾还原剂和300 mg锌粉，至少放置2 h后再消化。研究结果表明熏蒸与不熏蒸土壤提取液中硝态氮含量差异很小，在测定土壤MB-N时，可以不包括硝态

15、氮，即省略提取液中硝态氮还原过程。（3）消化：方法：吸取10.0 ml熏蒸与不熏蒸土壤0.5 mol L-1 K2SO4浸提液（或经还原反应后的浸提液）于250 ml消化管中，加入0.2 ml 0.19 mol L-1 CuSO4溶液、5 ml分析纯浓硫酸、及少量防瀑沸的颗粒物（如经浓硫酸处理并洗涤后烘干的瓷片，0.5 cm大小），混合液消化变清后再回流3 h。（4）消化液中氮测定：消化液冷却后，用去离子水洗涤转移到100 ml容量瓶中，至体积大约为70 ml，待再冷却后慢慢加入10 ml 10 mol L-1NaOH溶液中和部分H2SO4，边加边充分混匀（以免因局部碱浓度过高而引起消化液中N

16、H4+的损失），再用去离子水定容至100 ml。溶液中NH4+含量采用流动注射氮分析仪（FIAStar 5000型）测定。采用40 l样品圈，KTN扩散膜（耐强酸和强碱），载液为去离子水，试剂为4 mol L-1 NaOH溶液，试剂为指示剂溶液。校正曲线溶液制备：分别取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml 50 g N ml-1标准氯化铵溶液于100 ml容量瓶中，分别用去离子水洗涤转移1个空白消化液于容量瓶中，其余操作步骤同样品，用去离子水定容至100 ml，即得浓度分别为0、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g N ml-1系列标准氯化铵溶液，采用测定K

17、TN方法模块测定和制备工作曲线，校正曲线溶液最少应每个月制备一次。其他具体操作参见仪器使用说明。（5）计算(j sun)：土壤(trng)MB-N = EN / kEN式中：EN = 熏蒸(xnzhng)土壤提取的全氮 不熏蒸土壤提取的全氮；kEN为转换系数，取值0.45。三、土壤微生物生物量磷（氯仿熏蒸- NaHCO3提取Pi测定外加Pi校正法）1. 试剂（1）磷酸二氢钾溶液（KH2PO4）= 250 g P ml-1：称取1.0984 g经105烘23 h的分析纯KH2PO4，溶于蒸馏水并定容至1 L。（2）碳酸氢钠浸提液 c（NaHCO3）= 0.5 mol L-1，pH 8.5：称取4

18、2.0 g分析纯碳酸氢钠溶于800 ml蒸馏水，用1 mol L-1 NaOH调节溶液pH至8.5，再蒸馏水定容至1 L。该浸提液不能放置过久，否则因释放CO2使溶液pH值升高。（3）硫酸溶液c（H2SO4）= 2.5 mol L-1：量取70.0 ml分析纯浓硫酸（H2SO4，= 1.84 g ml-1），用蒸馏水稀释定容至500 ml即可。（4）钼酸铵溶液NH46Mo7O24 = 4 g 100 ml-1：称取20.0 g分析纯钼酸铵溶于蒸馏水，定容至500 ml，保存于耐热玻璃瓶中。（5）抗坏血酸溶液c（C6H8O6）= 0.1 mol L-1：称取1.32 g抗坏血酸溶于75 ml蒸馏

19、水即可。由于抗坏血酸极易氧化，因此必须在使用当天配制。（6）酒石酸锑钾溶液（Sb）= 1 mg ml-1：称取0.2743 g分析纯酒石酸锑钾溶于蒸馏水，定容到100 ml。（7）混合显色液配制：取上述125 ml硫酸溶液与37.5 ml钼酸铵溶液彻底混合，再加入75 ml抗坏血酸溶液和12.5 ml酒石酸锑钾溶液，混匀。此溶液保存时间不宜超过24 h。（8）标准磷酸二氢钾溶液（KH2PO4）= 4 g P ml-1：称取经105烘23 h的分析纯磷酸二氢钾0.1757 g，溶于蒸馏水，加入少量硫酸，用蒸馏水定容至1 L。得到浓度为40 g P ml-1标准磷贮存液，置4条件下保存。取50 m

20、l贮存液稀释至500 ml，即得到浓度为4 g P ml-1标准磷溶液，此溶液不宜久存。2. 仪器设备分光光度计（UV8500型）、离心机、塑料浸提瓶（125 ml）、容量瓶（25 ml）、烧杯（25 ml）、熏蒸、培养、提取等设备同上。3. 操作步骤（1）土壤前处理：同上。（2）熏蒸(xnzhng)和浸提：称取相当于4.0 g烘干(hn n)基重经前处理的新鲜土壤(5.0g)3份，分别(fnbi)置于25 ml烧杯中，用去乙醇氯仿熏蒸24 h，除去氯仿。将土壤无损转入125 ml塑料提取瓶中，加入80 ml 0.5 mol L-1 NaHCO3浸提液（土水比1 : 20），置于往复式振荡器中振荡浸提30 min（300 r min-1）。用慢速定量滤纸过滤。如果滤液浑浊，可采用双层滤纸过滤，或先离心8 min（3500 r min-1）后再过滤。在熏蒸的同时，另称取等量的土壤6份于浸提瓶中。其中3份作为不熏蒸“对照”，直接浸提剂进行浸提，浸提方法同上。另3份用于测定外加正磷酸盐态无机磷（Pi）的回收率，具体操作是分别加入0.5 ml 250 g P ml-1 KH2PO4溶液（外加无机磷的量相当于25 g P g-1土），再加入80 ml 0.5 mol L-1 NaHCO3浸提液进行