环境工程毕业论文(共39页)

1、 PAGE 47 南京(nn jn)林业大学 本科毕业设计(shj)（论文）题 目：植物酯酶的提取及纯化(chn hu)研究学 院： 化学工程学院 专 业： 环境工程 学 号： 070205223 学生姓名： 王康 指导教师： 范钦华 职 称: 讲师 二零一一 年 五 月 二十日摘 要 本文(bnwn)通过实验条件筛选(shixun)，初步确定了小麦酯酶的提取纯化(chn hu)方法及不同浓度的有机磷农药对酶活性的抑制效果，结果发现：如下： 1.通过单因素条件改变实验，确定了提取小麦粗酶液的固液比、温度、缓冲液pH值、提取时间、小麦粉目数的最优条件。 2.通过一次盐析及二次盐析，确定了通过盐析

2、法初步提纯酶液的饱和度条件及提纯效果。 3.验证了超滤法在小麦酶液纯化过程中去除盐分的可行性及对酶液纯化的效果。 4.通过Sephadex G100凝胶层析后，顺利将酶液的比活力提高了7.2倍，确定了纯化酶液的方法。 5.通过绘制毒死蜱对小麦脂酶的活性抑制标准曲线，确定了小麦脂酶对于有机磷农药抑制作用的线性表现。AbstractIn this paper, the extraction and purification plants for lipase extraction and purification of the conditions, and the mapping of the

3、organic phosphorus pesticide on wheat lipase inhibition standard curve, through literature review and selection of experimental conditions, initially identified wheat lipase Extraction and purification method and explore the inhibitory activity of organophosphorus pesticides for the preliminary natu

4、re of the experimental results are as follows: 1.Conditions by changing a single factor experiment, the crude enzyme extract of wheat solid-liquid ratio, temperature, buffer pH, extraction time, the best wheat flour mesh conditions. 2.And the second by a salting salting salting method determined by

5、the initial saturation of purified enzyme solution conditions and the purification effect. 3.Validated ultrafiltration method in the wheat enzyme purification process to remove salt feasibility and effect of the purified enzyme. 4.By Sephadex G100 gel chromatography, the successful enzyme specific a

6、ctivity will be increased 7.2 times to determine the method of solution of pure enzyme. 5.By drawing on wheat of chlorpyrifos inhibited the activity of lipase standard curve to determine the organic phosphorus pesticide for wheat lipase inhibition of linear performance.目 录前言(qin yn)61.文献(wnxin)综述7 1

7、.1有机磷农药(nngyo)7 1.1.1有机磷农药的特点7 1.1.2有机磷农药的毒性7 1.2农药检测方法8 1.2.1分析检测法8 1.2.2酶抑制法10 1.2.3两种酶抑制法比较11 1.2.4动物胆碱脂酶法11 1.2.5植物脂酶抑制法14 1.3植物脂酶的纯化及检测15 1.4总结15实验药品、器材及方法17 2.1.1实验药品与材料17 2.1.2实验器材17 2.2试剂配置17 2.2.1磷酸缓冲液配置17 2.2.2 0.8%固兰B盐溶液（显色剂）配置18 2.2.3-乙酸(y sun)萘脂丙酮溶液18 2.2.4考马斯亮蓝（显色剂）配置(pizh)18 2.2.5小麦粉制

8、取18 2.3实验(shyn)步骤19 2.3.1-奈酚标准曲线绘制19 2.3.2粗酶液提取19 2.3.3酶活的测定19 2.3.4蛋白质含量测定19 2.3.5硫酸安盐析20 2.3.6超滤20 2.3.7凝胶柱层析20 2.3.8毒死蜱抑制率曲线制作21实验结果22 3.1 -萘酚标准曲线22 3.2蛋白质标准曲线22 3.3粗酶液提取单因素条件结果23 3.3.1固液比23 3.3.2培养时间24 3.3.3缓冲液pH值24 3.3.4培养温度25 3.3.5小麦粉目数26 3.3.6粗酶液提取优化条件总结26 3.4一次盐析26 3.5二次盐析29 3.6超滤29 3.7凝胶柱层析

9、29 3.8毒死蜱对酶活抑制标准曲线314.实验(shyn)结论32致谢(zh xi)33参考文献34前 言农药作为重要的农业生产资料，在农产品生产中对病、虫、草、鼠害的防治起到了非常重要的作用，为人类(rnli)创造了巨大的经济效益，但同时也给环境安全和人体健康带来了一定威胁。在农业生产中应用的农药主要可分为四大类:第一类是以滴滴涕、六六六为代表的有机氯杀虫剂，这类杀虫剂由于致畸、致癌、致突变、高残留等缺点，已停止生产和使用;第二类是有机磷杀虫剂;第三类是氨基甲酸酷类杀虫剂;第四类是拟除虫菊酷类杀虫剂。在所有的农药中，有机磷农药是目前最常用的一类农药，它包括杀虫剂、杀菌剂、除草剂等，具有品种

10、多、防治对象多、杀虫效率高等特点，在各种农作物尤其是水果蔬菜生产中广泛应用。有机磷农药(nngyo)中的部分品种具有高毒性的特点，大量使用会造成环境污染、作物药害及人畜中毒。大多数有机磷农药(nngyo)具有手性，它们的一对对映异构体之间存在着不同的生物活性，包括毒性、酶抑制活性和生物降解(shn w jin ji)能力等。通过非手性分析得到的农药浓度所指示的可能与实际的生态毒理学效应并不相符，所以随着人类对环境污染物认识的不断深入，在对映体水平上研究农药的环境毒理学将会成为必然。近年来，由蔬菜中有机磷农药残留所引起的中毒现象十分严重。据世界卫生组织统计，全世界每年农药中毒人数约30万人，其中

11、有机磷农药中毒占70%。我国专家对为数众多的农药品种进行分级排队，从中筛选出的十种强污染农药中，有七种属于有机磷类，可见，农药残留检测的重点应该放在有机磷类杀虫剂。目前，在我国农药残留快速检测技术应用最多的是酶抑制法，其较高的灵敏性、准确性及低成本等优点已受到人们的广泛关注。酶抑制检测法由于具有能在短时间内检测大量样本，成本低、对操作人员技术要求不高、易于在农产品生产基地和批发市场推广等优点而受到广泛重视。本法的关键材料是敏感酶源，植物醋酶作为酶抑制法的生物识别元件由于其来源广泛、价格低廉，而且检测的灵敏性好，检测限低，可以满足农药残留检测普及化、市场化的要求，近年来得到了较多的关注，但深入研

12、究较少。因此本文选择小麦为酶源，深入研究了粗酶液提取的最佳条件，酶的进一步分离纯化以及毒死蜱对于小麦脂酶的抑制的线性性质。1.文献综述1.1有机磷农药(nngyo)1.1.1有机磷农药(nngyo)的特点 早在20世纪30年代，德国的SChrader就合成了一系列有机磷酸醋类化合物，并发现其中一些具有杀虫杀瞒活性。目前全世界有机磷杀虫剂的品种约为100余种，常用的有50多种。我国农药市场上有机磷品种30余个，占我国杀虫剂品种的38%，而产量却占75%。有机磷杀虫剂作为(zuwi)我国使用最广泛、用量最大的一类杀虫剂，其品种繁多，性能也千差万别。综合起来主要具有以下几个方面的特点1:绝大多数有机

13、磷杀虫剂在碱性条件下易分解。因此，不能与碱性物质混用在自然环境和动植物体内易降解。因此，在高等动物体内无累积毒性，正确使用时残留问题小，不致污染环境。杀虫效率高，广谱，作用方式多样(如触杀、喂毒、熏蒸)，不少品种为内吸杀虫剂，且许多品种同时又是杀瞒剂。化学结构复杂多变，品种多，适用范围广。毒性差异大。辛硫磷、马拉硫磷、敌百虫等毒性低，而对硫磷、甲拌磷为剧毒品种。总的来说，有机磷杀虫剂的毒性偏高。易解毒。对有机磷杀虫剂引起的急性中毒有特效的解毒药，如解磷定和阿托品。与有机氯农药、拟除虫菊醋类杀虫剂相比，害虫对有机磷杀虫剂的抗药性发展缓慢。1.1.2有机磷农药的毒性 目前国内外普遍使用的有机磷农药

14、被认为是非持久农药，其降解半衰期一般在几周至几个月。研究表明，有机磷农药在某些环境条件下也会有较长的残存期，并在动物体内产生蓄积作用;模拟实验也显示，在模拟降雨19d后，在地表径流中仍能检测到痕量的有机磷农药。据研究，对硫磷在苹果上降解半衰期为15一17d，在储存期，残留于苹果上的对硫磷的降解半衰期为13d2；;；长期食用农药残留超标的农副产品，虽然不会导致急性中毒，但可能引起人和动物慢性中毒，导致疾病的发生，甚至影响到下一代。试验证实，农药可能破坏某个特定的身体器官比如肝脏、肾、骨髓等，而且还会改变酶的活性，长期接触农药还会对人体有致畸、致癌作用。有关流行病学调查显示，恶性肿瘤的发病率逐年上

15、升与蔬菜中的农药残留有关。 作为典型的酶毒剂，有机磷农药可以通过消化道摄入，也可以通过皮肤(p f)、粘膜、呼吸道吸收3。有机磷的急性毒性主要归因于对胆碱能神经突触后膜上的乙酞胆碱醋酶活性的抑制，使酶不能起催化乙酞胆碱水解的作用，导致组织中能使神经过度兴奋的乙酞胆碱过量蓄积。这种乙酞胆碱传导介质代谢紊乱，可导致迟发性神经毒性，引起(ynq)运动失调、昏迷、呼吸中枢麻痹、瘫痪甚至死亡。有实验证明对氧磷和对硫磷酞化人脑胆碱醋酶一般约经4天即“老化”，酶活不易再恢复4。2农药检测(jin c)方法1.2.1分析检测法 农药残留分析方法是对待测样本中痕量农药残留进行定量和定性分析的技术，农药残留分析技

16、术既需要精细的微量操作手段，又需要高灵敏度的痕量检测技术。目前常用的方法包括色谱法、超临界流体技术以及近些年来发展迅速的快速检测法。(l)超临界流体技术超临界萃取技术 超临界流体萃取技术(supereritiea一FluidExtraetion，sFE)是利用超临界流体(SF)密度大、粘度低、扩散系数大、兼有气体的渗透性和液体的分配作用的性质，将样品中的待测物质溶解并从基体中提取出来的一种新的分离技术。它能同时完成萃取和分离两步操作，分离效率高、操作周期短、传质速度快、溶解力强、选择性高、无环境污染。近年来，SFE技术在农药残留分析中的应用随着SF的性质、萃取机理、过程控制的深入研究而日益(r

17、y)广泛，并显示其独特的优势。Juhler在用SF技术研究牛肉中的有机磷农药(OPS)和非有机磷农药(NOPS)及其混合物的残留量时，对超临界CO:的温度、压力、流量和提取时间对回收率的影响进行了考察，选择了适合不同样品(yngpn)、不同农药类型的操作条件，获得较好的回收率78%一95%和满意的检出限0.01一0.03m叭g，并确定了适合几种农药残留(cnli)联合分析的萃取条件5。将SFE萃取过程与气相色谱(GC)、液相色谱(HPLc)、毛细管柱液相色谱一GC联用可实现过程的自动化，减少样品用量、缩短分析时间、提高重现性、灵敏度和检出限。超临界流体色谱技术 超临界流体色谱技术(S叩erer

18、itiealFluidChromatogaphy，SFC)是以超临界流体为色谱流动相的分离技术，可以在较低温度下分析分子量较大、对热不稳定的化合物和极性较强的化合物;可与各种气相、高效液相色谱检测器匹配;可与红外、质谱联用。SFC弥补了GC和HPLC的不足，适用于分析热不稳定而HPLC又不易分析的化合物。许多在GC或HPLC上需要经过衍生化才能分析的农药，都可以用SFC直接测定。SFC可与SFE直接相联，使样品的提取、净化和测定一次完成。SFC与火焰光度检测器连接还可以分析番茄和洋葱中的乐果、马拉硫磷等。(2)色谱法 色谱法是根据分析物质在固定相和流动相之间分配系数的差异达到分离目的，当样品混

19、合物在两相相对运动时，各组分在两相中反复多次重新分配，结果使混合物得到分离，通过将被分析物质的浓度转换成易被测量的电信号(电压、电流等)，并送到记录仪记录下来。目前应用于农药残留检测的色谱法主要有薄层色谱法、气相色谱法和高效液相色谱法薄层色谱。薄层色谱法 薄层色谱法是利用(lyng)被检测物经显色后同标准有机磷农药(OPS)比较来定性，用薄层(bo cn)扫描仪来定量的测定方法。薄层色谱法显色反应类型多，显色剂范围广，快速，具有(jyu)不受物质的限定，在方法设计、拟定和实际应用上机动灵活，适用于对多种农药检测与鉴定。薄层层析法设备简单，操作方便，展开时间短，定性分离效果好，适用于微量成分的分

20、离和鉴定，也应用于各种有机化合物如亲水性物质或亲脂性物质等的分离、精制和鉴定分析。20世纪70年代，Kumar等对胆碱酷酶使用的显色基质及薄层定量方法进行了研究，近年来，国内开始关注植物胆碱酷酶的研究。杨娟，阮长青等利用有机磷农药抑制植物胆碱酷酶活性的原理，确定了小麦胆碱酷酶液与Q一乙酸蔡醋的酶促反应过程中的最大吸收波长、显色温度、显色时间以及酶液稀释倍数。通过酶抑制法与薄层层析的逐步分离过程相结合分析实现了10种常用有机磷农药的定性分析6，为分离有机磷农药多残留以及植物胆碱酷酶抑制法快速检测有机磷农药残留的深入研究提供依据。气相色谱法 气相色谱法(GC)是以惰性气体为流动相的柱色谱分离技术，

21、是目前检测有机磷农药的国家标准方法，该方法是利用经提取、纯化、浓缩后的OPs注入气相色谱柱，程序升温气化后，不同的OPs在固定相中分离，经不同的检测器检测扫描绘出气相色谱图，通过保留时间来定性，通过峰或峰面积与标准曲线对照来定量。具有即定性又定量、准确、灵敏度高，并且一次可以测定多种成分的优点。美国的EPAMethod1657就是使用GC来测定城市和工业废水中的45种有机磷农药;袁慧娟，宋国新等采用GC从s技术对上市蔬菜中有机磷类农药(甲胺磷、敌敌畏、久效磷、马拉硫磷等9种)残留同时测定。蔬菜样品经超声波提取、简单的净化处理后可直接进样分析。样品加标回收率在70%一127%之间，检测限为0.0

22、20.20mg/kg7。该分析方法简便、快速、准确，适用于蔬菜中农残的定性定量分析。高效(o xio)液相色谱法 高效液相色谱(HPLC)是以液体为流动相采用高压输液泵、高效固定相和高灵敏度检测器等装置的一种柱色谱分离技术，常用于挥发及热不稳定性的农药残留分析。李永新等采用高效液相色谱柱分离、紫外检测以及外标法定量，建立了同时测定蔬菜水果中12种农药残留的反相(fn xin)高效液相色谱分析方法。该方法的检测限为0.014林留L一0.0266协留L;在水果中的平均加标回收率为62.2%一118.2%，在蔬菜中的平均加标回收率为52.1%一124.6%8。陈珠灵等采用高效液相色谱法对蔬菜中甲基对

23、硫磷、乙基对硫磷、甲拌磷进行同时分离和检测，以Shim一packVP一ODS为分离柱，紫外检测波长为250nm，该方法(fngf)所测得的3种有机磷在0.02g/L一2.0g/L范围内具有良好的线性，检出限达1.0g/L一5.0g/L，加标回收率在97.44%一101.22%9。1.2.2.酶抑制法 目前检测有机磷农药残留普遍采用的方法如色谱法、超临界流体技术，检测结果准确，灵敏度高，但成本高，测定时间长，且需要具有一定技术水平的专业人员才能进行操作，只适合在实验室分析;而近些年来兴起的酶抑制法具有操作简便，速度快，适合现场检测、大批样品筛选检测以及我国小规模、分散的销售体系中经常性的现场快速

24、检测，因此作为一种检测农药的常用方法得到广泛应用。而如何选择酶源是实现快速、准确检测的关键。 胆碱脂酶广泛存在于动物的组织中，1953年stedman等首先从马血清中分离出乙酞胆碱脂酶，此后不同来源的乙酰胆碱脂酶相继得到纯化和研究10。目前已分离纯化的动物来源的乙酰胆碱脂酶主要集中(jzhng)在动物肝脏和血液，如猪肝，鸡血等。也有利用蛆蝴以及海洋鱼类，甲壳类动物的神经组织(zzh)，脑组织分离乙酰胆碱脂酶1113。近年来很多学者致力于从昆虫体内提取乙酰胆碱脂酶如:家蝇、麦二叉蚜、黄猩猩果蝇、烟草天蛾、光叶库蚊、黄粉甲、美洲淤夜蛾、豆荚草盲蜷、马铃薯叶甲、骚扰角蝇、棉铃虫等。迄今为止，酶抑制法

25、进行农药残留检测以从敏感家蝇中提取的乙酰胆碱脂酶效果最佳，其敏感性优于其他来源的乙酰胆碱脂酶，更有进一步研究表明，家蝇羽化后2一3d时其头部的乙酰胆碱脂酶敏感性最高。植物来源的脂酶作为农药残留检测的三种酶标记物之一，由于其来源广泛、价格低廉，近年来得到了较多的关注。但是，几乎所有的研究都是直接以面粉作为酶源，筛选用于农残检测的最佳小麦品种或者是以面粉作为酶标记物，制成酶片，对酶片检测农残显色反应的温度、时间、显色剂的选择等方面进行比较研究。尚未见到用提取纯化的酷酶制品(zhpn)对大量有机磷农药的灵敏性和最低检测限进行研究的报道。1.2.3两种酶抑制法的比较 酶抑制法测定有机磷农药残留是根据有

26、机磷农药的毒性对酶分解底物的抑制作用进行的，其酶源有来自动物的胆碱酷酶和从植物中提取的植物酷酶。动物胆碱酷酶法是基于有机磷农药的毒性抑制乙酞胆碱酷酶催化底物水解生成乙酸和胆碱，后者与5，5一二硫代一双一2一硝基苯甲酸反应，生成黄色产物5一硫代一2一硝基苯甲酸，其在410nln处有最大吸收，测定其在单位时间内的生成量，即可测得乙酞胆碱酷酶的活性。植物酷酶可以催化乙酸蔡酷水解为蔡酚和乙酸，蔡酚与显色剂固B作用形成紫红色的偶氮化合物，从而发生显色反应，具体反应见下式。 有机磷农药能抑制植物脂酶的活性，使反应(fnyng)速率发生变化，紫红色的偶氮化合物产量(chnling)不同，吸光度值也不同，即酶

27、的活性受到抑制的程度不同14。很多学者经过大量实验，比较了动物脂酶和植物脂酶反应(fnyng)的条件、总脂酶活力和灵敏度，并对其检测条件进行了优化。2004年黄志勇等比较了快速测定蔬菜中有机磷农残的胆碱脂酶抑制法和植物脂酶抑制法，并通过正交实验优化了两种酶抑制法的测定条件。结果发现两种酶抑制快速测定方法均可用于蔬菜中有机磷农残的测定，其加标回收率都达到85%以上，但植物脂酶法测量精密度更胜一筹14。而后对植物脂酶和动物脂酶在不同pH值下的酶活、抑制程度等性质进行的实验研究也表明了动物脂酶中的苍蝇酶、蝇蛆酶与植物脂酶中的小麦脂酶相比，它们的活力和被农药抑制程度处于相近的水平15。可见，植物酷酶与

28、动物酷酶均可用于蔬菜中有机磷农药残留的快速测定，而且两种酶抑制法测量的精密度都较好，准确度也相当。与动物脂酶相比，植物脂酶的酶活、抑制程度等各项指标均不逊色。此外，植物脂酶具有来源方便、成本低的优势，能够稳定而准确地检测到浓度为10-3mol/L的敌敌畏，达到了其安全限值16。1.2.4动物(dngw)胆碱脂酶法 自从1951年发现有机磷农药(nngyo)在体外也能抑制胆碱脂酶以来，绝大多数研究都是基于动物胆碱脂酶这一原理进行的。目前，胆碱脂酶法检测有机磷的方法主要有酶片法、酶抑制分光光度法以及胆碱脂酶生物传感器法。(1)酶片法酶片法是将敏感生物的胆碱脂酶和生色基质液经固化处理后加载到滤纸片或

29、类似载体物质上，基质在胆碱脂酶的催化作用下迅速分解，生成胆碱(蓝色）和乙酸。有机磷和氨基甲酸酷农药对胆碱脂酶有抑制作用，使催化、水解、变色的过程发生改变。将胆碱脂酶与样品提取液反应，若胆碱脂酶受到抑制，基质就不能水解、不变色，表明(biomng)样品中含有机磷和氨基甲酸脂类农药(呈阳性)。目前广泛使用的速测箱、速测卡法均属于酶片法。近年来国内常见的用固化含有胆碱脂酶和靛酚乙酸醋试剂的试纸片建立的适合我国蔬菜中部分农药残留限量的现场监督检测的速测卡法，其检出限一般在0.3一3.5m叭g，检出时间为15min，操作简单，速度快，测试成本低廉17。也有学者利用马血清中的乙酰胆碱脂酶与底物氯化乙酞胆碱

30、作用，根据反应前后的pH值变化及指示剂的颜色变化情况，建立的一种可以作定性及半定量分析的酶片快速检测法，应用于实际检测黄瓜中农药残的效果较好18。在国外方面，Hwa一YoungNO和YoungAhKim等用涂有乙酰胆碱脂酶的试纸检测样品中农药残留的含量，实验表明以HybondN+为酶载体，苯基乙酸脂为底物最合适，此时有机磷和氨基甲酸酷类农药的检出限分别为:10-6102和10-6100g/mL，实验还发现:与对氧磷相比，试纸法对被氧化的对氧磷更敏感19。(2)酶抑制分光光度法 有机磷类农药对乙酰胆碱脂酶活性有抑制作用，浓度越高，抑制率越高。通过分光光度计测定吸光度随时间的变化值，并与空白对照比

31、较求得酶抑制率，从而判定样品中是否有有机磷或氨基甲酸酷类农药的存在。该法所需仪器设备简单、灵敏度高、前处理简单、检测时间短，可及时检测含农残的蔬菜。曾有报道以鸡脑为酶源提取乙酞胆碱醋酶，利用酶抑制分光光度法检测油白菜中有机磷农药(对硫磷、辛硫磷、氧化乐果)的残留量，可使3种农药的回收率分别达到97%，101%和99%。Ingridwalt等从镰刀菌pisi中提取角质酶，利用酶抑制分光光度法和%孔板法同时检测多个样品中有机磷和氨基甲酸酷类杀虫剂的含量，该法对毒死蟀和对氧磷的检测限分别为2.6mg/L和0.04mg/L。(3)胆碱(dn jin)酷酶生物传感器胆碱醋酶生物传感器法是目前农药残留速测

32、技术中的研究热点，其在研究方法多样化、灵敏度、准确性、响应时间等方面都具有很大优势。方法较为多样化，主要包含了电化学型、光化学型以及压电型，与本文关系不大，不做具体(jt)介绍。1.2.5植物(zhw)脂酶抑制法 酶法快速检测农药残留的方法中，多采用敏感家蝇头部获得的乙酞胆碱醋酶，但是动物酷酶常表现为保持期短，需冷冻低温保存。而植物酷酶酶源丰富，提取和保存较为方便，只需以一定比例的水或缓冲液混合离心获得的上清液即可作为粗酶液，并在一4保存即可。而且与动物醋酶相比，植物酷酶抑制法的测量准确度和精密度均不逊色，能达到快速检测农药残留的目的。1987年，中国农业部环保所研制出一种酶片和显色基质片，不

33、需仪器，即可在田间或菜市场快速测定蔬菜和水果中的有机磷类农药，其检测限为0.5一10mg/kg。而后有人利用自制的植物酶片和高灵敏度化学检测液(速测灵)，使检测出有机磷农药残留的灵敏度达到0.4一10mg/L和0.18一10mg/kg，检测时间为5一10min，检测成本为0.2一0.3元人民币20,21。至此，植物酷酶法检测有机磷农药残留开始受到了研究学者的广泛关注，各方面的研究也随即展开。在酶源的筛选方面，依据对有机磷农药的敏感性而定，许多研究者直接从面粉中提取酶，但不同的小麦酶对农药的敏感性不同即使对于同一品种小麦，产地不同、种植方法不同、所处生长期不同时，其对农药的敏感度也会存在较大差异

34、。因此，需要作进一步的研究，以确定可以进行定量分析而且具有互换性的植物脂酶酶源。在显色液方面，由于酶抑制法检测农药残留常需借助于固蓝B盐和乙酸萘脂组成的生色基质液的显色完成。但该显色液非常不稳定，在室温下40min以后显色能力大大下降，不能再用来测定，需现用现配，这给检测工作带来了诸多不便23。为此，董超等改进了显色剂的配方，将其制成固体显色剂，大大延长了显色剂的有效使用期限，使其在室温下放置3个月后性能不变，且该法对甲胺磷、敌敌畏、对硫磷、辛硫磷等的检出浓度为10-410-7（V/V）24。也有学者改用其它显色剂一2，6一二氯乙酰靛酚，先用植物酷酶水解橙色的2，6一二氯乙酸靛酚，然后用分光光

35、度法测定分解的靛酚(蓝色)吸光度，计算可得有机磷的含量，该法对常用的几种有机磷及氨基甲酸脂类农药的测定限均在0.0015一0.3300mg/L范围内。通过进一步实验比较两种不同显色剂(2，6一二氯靛酚乙脂和固蓝B盐的显色原理与性能，证实了采用2，6一二氯靛酚乙酷既兼顾了底物和显色剂的双重作用，且从显色底物液使用的方便程度、稳定性以及便于现场快速检测等方面看，使用2，6一二氯靛酚乙醋显色剂比用固蓝B盐来显色更具有优越性25,26。进一步研究还发现了小麦酷酶活性与保存温度的关系:在20储存sd酶活只剩余39.6%，在4储藏sd剩余75.6%，酶活衰退较快，而将该酶用液氮在一1%保存sd，酶活仍有9

36、7.5%，可见酶的保存需要较低的温度177。近年来研究人员主要利用酶固定化技术解决酶液难以贮藏的问题，如用离子交换树酷作为固定化载体对植物酷酶进行固定化，不仅可使酶的稳定性大大提高，而且与游离酷酶相比，对农药抑制的响应敏感性也有明显的提高。也有选用聚苯乙烯微孔反应板作为酶的载体，将自制的植物醋酶固定在载体上的微孔内壁表面，制成农药快速检测板，检测有机磷和氨基甲酸酷类农药的灵敏度可达0.01mg/kg0.lmg/kg。最近有报道采用原位溶胶一凝胶法制备PVA/SiO2有机/无机杂化溶胶，并将显色剂和植物酷酶分散于溶胶中，制成一类亲水一亲丙酮可调，贮存性好的传感膜。固定于该杂化膜中酶的稳定性在冷藏

37、和室温条件下均比在溶液状态下有明显提高。由此可见，酶的固定化方法在检测农药残留中将起到非常重要的作用。1.3植物脂酶的纯化(chn hu)及检测 关于酷酶的提取纯化，国外的研究大多集中在从假丝酵母(jiom)、霉菌、假单胞菌、细菌、链球菌、乳酸菌、醋酸菌等菌类中提取，只见到ChristinaeStuhleflder等通过硫酸钱盐析沉淀、Q一sPeharose层析等步骤提取西红柿中的植物酷酶27。国内也仅见到纪淑娟等通过水提取、离心、硫酸馁盐析沉淀以及Sephadex G200凝胶层析从小麦种子中提纯醋酶。关于农药残留检测(jin c)用植物酷酶的来源，近年来有很多的研究报道直接以市售面粉作为酶

38、原，用面粉中的植物醋酶检测农药残留，在面粉中按一定比例加入蒸馏水，振荡离心所得溶液即为检测用的脂酶溶液。少见有人对植物脂酶的提取、纯化工艺进行进一步的研究确定。 1.4小结(xioji) 本章介绍了有机磷农药的特点、毒性及其酶抑制活性等方面的研究(ynji)情况，综述了国内外对酶抑制法检测有机磷农药的研究进展。综上所述，笔者认为(rnwi)，目前植物脂酶的研究多为直接用面粉作为酶源，研究具体测定方法，缺少对植物脂酶这个检测材料进一步纯化的研究，而此项研究对于为进一步提高酶抑制法测定农药的效果以及提高酶抑制法的实际应用性能提供必要的理论支持是十分必要的;随着人们对蔬菜中农药残留及食品安全性问题的

39、关注，进一步探索更有效的分离纯化方法，更大程度地提高植物醋酶法的检测灵敏度和准确性也具有较大的现实意义。此外，研制便宜、简便、准确的农药速测仪器，尽快将研究成果投入实际运用;对植物醋酶的结构进行研究，明确其作用靶标部位都是该领域值得研究的方向。2实验(shyn)部分(b fen)2.1实验材料(cilio)与器材2.1.1药品、试剂与材料 丙酮、甲醇、甲醛、乙醇（95%)、磷酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸铵、氯化钠 -乙酸萘脂 -萘酚 固兰B盐 考马斯亮蓝 微孔滤膜 超滤膜 Sephadex G100凝胶 小麦种子 毒死蜱 压缩(y su)氮气2.1.2实验(shyn)器材 高速(o s)粉

40、碎机 检验筛（20目100目） 恒温水浴振荡器 恒温水浴锅 台式高速离心机 紫外可见分光光度计 层析柱2.2.试剂配制2.2.1磷酸缓冲液 22.24g磷酸二氢钠定容至1L得0.2mol/L磷酸二氢钠溶液 73.2g十二水合磷酸氢二钠定容至1L得0.2mol/L磷酸氢二钠溶液按下表混合后可得不同PH值的缓冲液。表2.1pH值0.2mol/LNa2HPO4溶液（%）0.2mol/LNaH2PO4溶液（%）5.88.092.05.910.090.06.012.387.76.531.568.57.061.039.07.584.016.08.094.75.32.2.2 0.8%固兰B盐溶液（显色剂）称

41、取3.6g SDS溶解(rngji)于100ml蒸馏水，称取0.8g固兰B盐，加入SDS溶液中溶解，用微孔(wi kn)滤膜过滤，滤液即为固兰B溶液。2.2.3-乙酸萘脂丙酮(bn tn)溶液 称取0.3724g-乙酸奈脂，溶于丙酮后定容至50mL。2.2.4考马斯亮蓝准确称取350mg考马斯亮蓝溶于100mL95%的乙醇中，然后加入2O0mL88%(w/v)的磷酸，得到Bradford储存液;取30mLBradford储存液，并加入30mL88%的磷酸、1m5L9%5的乙醇、425mL蒸馏水，得到Bradford工作液50OmL，然后用1号滤纸过滤，室温保存于棕色瓶中备用。2.2.5小麦粉制

42、取把挑选好的小麦种子置于高速粉碎机中粉碎，打开开关，每粉碎10秒需关闭20秒，防止过热而使小麦脂酶失活。粉碎完毕后过筛收集至广口试剂瓶保存与冰箱中。2.3实验方法2.3.1-奈酚标准曲线绘制 称取0.0036g-奈酚，溶解于蒸馏水定容至100mL，得0.25mol/mL溶液。 用移液管分别移取2.5mL、2.0mL、1.5mL、1.0mL、0.5mL-萘酚溶液，用缓冲液稀释至3mL，再取3mL缓冲液作空白。 在6支25mL比色管中分别加入上述溶液和0.5mL0.8%固兰B盐-3.6%SDS显色剂，置于30摄氏度恒温水浴5min后做光谱扫描，并在最高吸收峰测吸光度。 用测得的结果做标准曲线2.3

43、.2粗酶液提取称去一定量制得的小麦粉与一定量缓冲液充分(chngfn)混合后于恒温水浴振荡器中培养一定时间后将充分混合的液体于在台式高速离心机中于8000rpm离心10min，得粗酶液。2.3.3酶活的测定(cdng)参照李绍中等方法并加以改进。将酶液按一定(ydng)比例稀释，取3 mL稀释酶液，加入0.5mL的0.04mol/L-乙酸萘酯丙酮溶液，漩涡震荡均匀，30恒温水浴5 min。之后加入0.5mL 0.8%固兰B盐-3.6%SDS混合溶液，漩涡震荡均匀，于30恒温水浴5 min。用未加-乙酸萘酯的反应液作空白，待1 min读数稳定后在595nm处读取OD值。计算酶液的活性：式中，E酯

44、酶活性，U/mL；C酶液的稀释倍数；k-萘酚标准曲线的斜率；y-萘酚标准曲线的截距；OD反应液的吸光度；V反应酶液的体积，mL；U酶活单位，mol/min。282.3.4蛋白质含量测定取0.5克酶液于比色管中，加入5mL考玛斯亮蓝工作液，混合后于37保温10min后于595nm测吸光度，对应标准曲线得到蛋白质含量。2.3.5硫酸铵盐析单次盐析在提取好的粗酶液中加入一定量的硫酸铵，缓慢加入确保完全溶解以防止局部浓度过大，待硫酸铵全部溶解后将酶液放入冰箱中，24h后将酶液取出，与台式高速离心机中离心10min，将上清液取出测酶活及蛋白质含量。二次盐析在提取好的粗酶液中加入一定量的硫酸铵，缓慢加入以

45、确保全部溶解后，放入冰箱中。24h后取出，离心(lxn)并弃去沉淀后在上清液中再加入一定量硫酸铵，放入冰箱，24h后取出并离心。离心后取沉淀溶解，得到盐析提纯后的酶液。2.3.6超滤 将盐析(yn x)后的酶液用1号 所得酶液倒入组装好的超滤器中，接通(ji tn)压缩氮气，以0.15MPa超滤24h。得到超滤后的酶液。2.3.7凝胶柱层析 Sephadex G-100凝胶预处理 A.100ml烧杯，称取5克sephadex G-100,加入50ml去离子水，浸泡溶胀24小时。 B.倾去sephadex G-100溶胀后凝胶上层的水，加入凝胶等体积的1.0 mol/L NaOH液处理，用搅棒轻

46、轻搅动，并浸泡1小时处理后倾去。用去离子水洗涤。洗涤过程中，用倾去法除去 细颗粒。其方法是用搅棒将凝胶搅匀（注意不要过分用力搅拌，以防止颗粒破碎），放置数分钟，将未沉淀的细颗粒随上层水倒掉。浮选3-5次，直至上层没有细颗粒为止，再浸泡水洗至PH中性。 C.将Sephadex G-100凝胶水溶液盛放于抽滤瓶中，用洗耳球塞住杯口，减压抽气30分钟，除去凝胶溶液内的气泡，将脱气后的凝胶溶液轻轻倒入烧杯中，其中盛有1/2去离子水。 装柱 A.层析柱(1.050cm)用水清洗干净，柱的上、下端联接塑料管接上小乳胶管，装上螺旋夹。将层析柱垂直装好。校直过程用下端绑有钥匙的绳子挂于铁架的不同位置，从多角度

47、校正使柱垂直。打开柱上端口，从柱底下出口管朝柱内注入水，使柱底全部充满水而不留气泡，关闭柱出口。最终柱内留存有2 cm的水。从出口处接上一根直径2 mm细塑管，塑管另一端固定在柱的上端部位。 B.搅动凝胶溶液（切勿搅动太快，以免空气再逸入），使形成均一的薄胶浆，并立即沿玻棒倒入层析管内，让加入的凝胶在柱内自然(zrn)沉降，待柱底面上积起约1-2 cm的凝胶床后，打开柱出口水流。随着柱内水的流出，上面不断加入凝胶液，使形成的凝胶床面上有凝胶连续(linx)下降（如果凝胶床面上不再有凝胶颗粒下降，应该用搅棒均匀地将凝胶床搅起数厘米高，然后再加凝胶，不然就会形成界面，影响层析效果）。 C.凝胶沉积

48、到柱内凝胶是否均匀，有否“纹路(wn l)”或气泡。若层析柱不均一，必须重新装柱。洗脱 在装好的层析柱中加4mL二次盐析后的酶液，在梯度洗脱器的一端加蒸馏水，一端加0.2mol氯化钠溶，液调节兰格蠕动泵转速为3.5rpm，梯度洗脱，并打开电脑记录洗脱液在280nm处的吸光度，并用自动收集器收集洗脱后的液体。待出现吸收峰后稳定一段时间，不再有吸收峰出现后，取吸收峰附近时间的洗脱液测酶活及蛋白质含量。2.3.8毒死蜱抑制率曲线制作 取0.5mL485g/L的毒死蜱，用一定量水溶解后用石油醚混合于分液漏斗中，静置分层，萃取后将石油醚定溶至50mL，再将其稀释，直至浓度为48.5mg/L，分别将其稀释

49、到24.25mg/L、19.4mg/L、14.55mg/L、9.7mg/L、4.85mg/L，各取0.5ml与0.5ml的酶液混合均匀后测定酶活，并取以份不加农药的酶液作为参照，于分光光度计606nm处测吸光度，以毒死蜱浓度为X轴，酶活力抑制率为Y轴绘制标准曲线。3.实验(shyn)结果3.1-萘酚标准(biozhn)曲线表3-1-萘酚含量0.0050.0100.0150.0200.025吸光度0.1590.3240.5040.6720.817 测得上表数据后，依照(yzho)实验方法绘制下图，得到-萘酚标准曲线如图图3-1： 图3-13.2蛋白质标准曲线数据应用自：胡晓燕，有机磷农药对植物醋

50、酶的抑制及应用研究得到蛋白质标准曲线图3-2：3.3粗酶液提取单因素(yn s)条件结果3.3.1固液比图3-3分别(fnbi)称取10g小麦粉置于5个锥形瓶中。量取60mL，70mL，80mL，90mL，100mL缓冲液，倒入5个锥形瓶中与小麦粉充分(chngfn)混合。将混合好的锥形瓶固定于恒温水浴振荡器中，以185rpm，40培养4小时。培养完成后，离心取得粗酶液稀释并测酶活，得到1:7固液比下有最高酶活力0.348U/mL。以其为100%得到图3-3，并确定(qudng)最佳固液比为1:7.3.3.2培养时间图3-4：分别(fnbi)称取10g小麦粉置于8个锥形瓶中，以1：7固液比与缓

51、冲液混合均匀放置(fngzh)于恒温水浴振荡器中，在185rpm，40下分别(fnbi)培养1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h。每个样培养完成后于高速台式离心机以8000rpm离心10min得粗酶液，稀释并测酶活，得到酶活力在4h时有最大值0.461U/mL，以其为100%作图得图3-4，并确定最佳培养时间为4h。3.3.3缓冲液pH值图3-5：按表2.1配得pH为6、6.5、7、7.5、8的缓冲液，分别(fnbi)量取70mL后与10g面粉充分(chngfn)混合后置于恒温水浴振荡器上以185rpm、40培养4h，培养结束(jish)后于高速台式离心机以8000rpm离心10mi

52、n后得粗酶液，稀释并测酶活，得到pH=7.5时有最大酶活力0.236。以其为100%作图，得到图3-5，并确定最佳pH值为7.5。3.3.4培养温度图3-6：分别称取10g小麦粉置于6个锥形瓶中，以1：7固液比用pH7.5缓冲液充分混合后置于恒温水浴振荡器中，以185rpm培养，调节培养温度分别为20、25、30、35、40、45，培养4h后于高速台式离心机以8000rpm离心10min后得粗酶液，稀释并测酶活，得到在35时有最大酶活0.222U/mL。以改值为100%作图，得图3-6，并确定最佳提取温度为35。3.3.5小麦粉目数图3-7: 将小麦置于高速粉碎机粉碎后的产物(chnw)分别过

53、100目、80目、60目、35目、20目的检验筛，各得10g小麦粉后与70mL缓冲液于锥形瓶中混合(hnh)均匀，置于恒温水浴振荡器中以185rpm，35培养4h，培养结束(jish)后于高速台式离心机中以8000rpm离心10min后得粗酶液，稀释并测酶活，在80目时有最大酶活0.426U/mL。以该值为100%作图，得图3-7并确定最佳小麦粉目数为80目。3.3.6粗酶液提取优化条件总结 依据上述3.3.13.3.5实验结果，可以得到小麦脂酶粗酶液提取最佳条件如下表表3-2：固液比培养时间缓冲液pH值培养温度小麦粉目数1：74h7.53580目3.4一次盐析(yn x)图3-8：图3-9：

54、图3-10：图3-11:图3-12：图3-13：通过对图3-8至图3-13的分析，可以看出(kn ch)，在硫酸铵饱和度为20%时，既能够将一定量杂蛋白通过沉淀取出，又能在上清液中保留较大部分的酶活，宜将20%饱和度作为二次盐析中的第一此盐析的硫酸铵浓度，并且弃去沉淀而取上清液。在硫酸铵饱和度为60%时，上清液中包含了大部分杂蛋白，而沉淀中保存了大部分酶活。因此，宜将60%饱和度作为二次盐析中的第二次盐析硫酸铵浓度，弃去上清液，去沉淀再溶解后进入下一步处理。3.5二次盐析(yn x) 二次盐析后，测得酶液中酶活力为0.347U/mL，蛋白质含量为2.4mg/mL，比活力相较于盐析前的0.045

55、U/mg提高了3.22倍，说明二次盐析起到了去除(q ch)除一部分杂蛋白的效果，达到了初步提纯的目的。3.6超滤 将酶液稀释超滤后，测得酶活力为0.0178U/mL，蛋白质含量为0.0747mg/mL。比活力为0.238U/mg。超滤能够起到取出盐分的作用，并且能够去除一部分杂蛋白，相较于超滤前，比活力提高了1.64倍，在去除盐分的同时得到了一定的提纯效果。3.7凝胶柱层析表3-3：洗脱时间时间36h37h38h39h40h蛋白质（mg/mL）0.004430.008210.01010.008230.0043酶活（U/mL）0.002610.006140.01160.01410.00501比

56、活力（U/mg）0.59 0.75 1.15 1.71 1.17 吸光度0.190.250.410.320.21电脑实时间记录显示在38h时，280nm处出现了蛋白质吸收峰，将38h附近5个样取出并测酶活及蛋白质含量后，得到表3-3中的数值，按所得数据(shj)绘图，得图3-14及3-15。图3-14：图3-15： 根据图示，发现在层析过程中，酶活力的峰值要稍滞后于蛋白质吸收峰值的出现，最高比活力相较于层析前得到了7.2倍的提升，取得了相当好的提纯效果。充分说明凝胶柱层析对酶的提取(tq)纯化有相当好的效果，进一步纯化可以得到纯酶。3.8毒死蜱对于小麦脂酶抑制的标准曲线(qxin)绘制 通过一

57、定浓度毒死蜱对于小麦酶液的的抑制(yzh)而绘制的标准曲线表明，毒死蜱对于小麦活性确实存在着线性关系，并且线性关系较好。R2=0.9979精度较高。4实验(shyn)结论4.1粗酶液最优提取(tq)条件确定 依据(yj)3.3.13.3.5实验结果，可以得到小麦脂酶粗酶液提取最佳条件如下表：固液比培养时间缓冲液pH值培养温度小麦粉目数1：74h7.53580目 通过这些实验，确定了粗酶液提取的最优条件，对后续续研究提供了先决条件，方便了粗酶液的快速提取，对于农药初步检测有着积极意义。4.2粗酶液提纯的探索 通过盐析、超滤、凝胶层析等方法，将酶液比活力从0.045U/mg提高到了1.71U/mg

58、，为提取出纯酶液进行进一步研究提供了实验方法和条件，提高了对植物脂酶提纯的认识，确定了这些方法的可行性。4.3有机磷农药对于(duy)小麦脂酶的活性抑制 通过绘制毒死蜱抑制(yzh)小麦脂酶活性的标准曲线，确定了小麦脂酶活性与毒死蜱含量之间的线性关系，证实了利用小麦脂酶测定农药含量有可行性并且有相当的精确度。致 谢 本论文是在范钦华老师的悉心指导下完成的。一直以来老师严谨求实的治学态度，独到(ddo)的见解，执著探索的精神给作者留下了深刻的印象，使作者终身受益。在论文的完成过程中，导师注重作者科研能力和综合素质的培养，帮助作者开阔思路，把握方向为本文的顺利完成倾注了大量的时间和精力。在此，谨向尊敬的恩师致以崇高的敬意。参考文献1张一宾，张怪.农药(nngyo)M.北京:中国物资出版社.1997，279一280.2安凤春，莫汉宏，王大华，等.对硫磷在苹果上的残留动态(dngti)J.农业环境保护，2001，20(2):11一119.3纽伟民，赵晓联，赵春城.有机磷农药检测方法综述J.江苏食品(shpn)与发酵，2001，22(l):28一30.4李劲彤，张雨.对硫磷与对氧磷抑制人脑乙酞胆碱醋酶的老化及重活化J.中国药理学和毒理学杂志，2002，16(2):143一146.5JuhlerRK.Super