尿素-SDS-PAGE测定小分子多肽相对分子质量方法的建立

1、尿素-SDS测定小分子多肽相对分子质量方法的建立王丽荣，程福亮，陈雷，谷巍(山东宝来利来生物工程股份有限公司，山东泰安271000)摘要：目的建立一种简易快速测定小分子多肽相对分子质量的SDS电泳方法。方法通过改进分离胶交联度为6%，丙烯酰胺总浓度为15%，并加入6%的尿素，对所测得的多肽相对分子质量进行线性回归分析。结果得到的标准曲线线性相关系数r2达到0.9938，测得条带的相对分子质量分别为9.2129KD。结论本研究建立的方法操作简单、耗时短，且小分子多肽成像清晰，是一种具有很高实用价值的测定方法。关键字：SDS；小分子多肽；尿素；相对分子质量；转移因子口服液Developmentof

2、Urea-SDSMethodfortherelativemolecularmassofsmallmolecularpeptideWANGLI-RongCHENGFu-LiangCHENLeiGUWei(ShandongBaoLai-LeeLaibioengineeringCo.Ltd,Taian,Shandong,271000)Abstract:ObjectiveInordertoestablishasimpleandrapidmeasuringmethodSDSoftherelativemolecularmassofsmallmolecularpeptide.Methodbyimprovin

3、gtheseparationgel,thecrosslinkingdegreewas6%,totalacrylamideconcentrationwas15%,and6%ofureawasadded,therelativemolecularmasspeptideswasobtainedbylinearregressionanalysis.Resultsthelinearcorrelationcoefficientofthestandardcurveis0.9938,andtherelativemolecularmassofthetargetproteinbandswasmeasuredtobe

4、9.2129KD.Conclusionsthisstudyestablishedthemethodofsimpleoperation,shorttimeconsuming,andclearimaging,so,asakindofmeasuringmethodoftherelativemolecularmasspeptidesofsmallmolecularpeptide,ithasahighpracticalvalue.Keywords:SDS;smallmolecularpeptide;relativemolecularmass;urea蛋白质的生化分析和基因表达产物的分离纯化中，难免会需要

5、分离某种或某些小分子蛋白质成分。近年来，用电泳法测定分子量在几千道尔顿小分子多肽分子量的研究报道较少。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)方法用作蛋白质大分子量测定的技术最早由Shapiro等人于20世纪60年代建立12，之后Weber等人进行了改进，显示出了该方法在分离鉴定和纯化蛋白质方面的优越性3。20世纪80年代初，Schabgger等应用脲分离蛋白质复合体亚单位的11种蛋白质，进行了系统地研究和摸索，能够分离较大相对分子质量范围内的蛋白质。随着生物技术的飞速发展和基因工程药物的大量涌现，具有高生物活性的小分子多肽的分离、纯化和鉴定已显得尤为突出，而小分子多肽分子量的测定，目前多采用Tr

6、icine-SDS系统PQ，但系统中的Tricine价格昂贵，电泳时间较长，且由于小分子多肽相对分子质量小，易受电泳缓冲系统、凝胶浓度、电泳时间、染色和脱色等的影响，极易引起条带扩散、不易着色，使分辨率降低，因而直接影响多肽分子量的测定。现有多肽分子量的三层胶电泳测定方法操作复杂，且结果也不理想。报道也有张晓楠等8采用尿素SDS法快速测定了Mr为250017000的多肽，郭燕捷等円和石继红等问也分别对小分子肽类进行了测定oKyte等11发现由25250个残基组成的多肽可用含有8mol/L尿素和0.1%SDS的20%PAGE来分离。转移因子(TF)属于淋巴因子，可特异或非特异性地调节机体免疫状态

7、、增强其细胞免疫【收稿日期作者简介王丽荣(1985-),女,汉，硕士研究生，山东莱阳人，主要研究方向：禽病学、中药发酵。和骨髓造血功能，已在临床应用多年，在原发性免疫缺陷病或慢性病毒感染疾病中作为免疫治疗药物作用，目前已得到肯定，特别是对病毒性上呼吸道感染治疗取得良好效果12。主要成份为小分子多肽和核苷酸，为免疫调节剂。本研究根据小分子多肽条带分辨率高、操作简便、分析时间少、低成本等原则，旨在改进低分子量蛋白一一专移因子的尿素-SDS方法，并为小分子多肽相对分子质量的测定提供有效方法。1材料与方法1.1实验材料垂直电泳仪及其配件、PowerPAC200稳压稳流电源，Bio-Rad公司；GDS2

8、8000凝胶图像处理系统，英国UVP公司。低分子量蛋白Marker购于北京天恩泽基因科技有限公司；小分子多肽样品由山东宝来利来生物工程股份有限公司研究院保存。试剂及配制30%丙烯酰胺：称取29g丙烯酰胺和lgN,N-亚甲双丙烯酰胺溶于80ml超纯水中，然后定容至100ml。0.45um滤膜过滤后，测PH值。10%SDS：称取10gSDS溶于80ml超纯水中，然后定容至100ml。1.5MTris-CL：称取18.171gTris-Base溶于80ml超纯水中，用浓盐酸调整PH值至8.8,然后定容至100ml。0.5MTris-CL：称取6.057gTris-Base溶于80ml超纯水中，用浓盐

9、酸调整PH值至6.8,然后定容至100ml。10%APS：称取2.282g过硫酸铵溶于8ml超纯水中，定容至10ml。RunningBuffer:称取3.03克Tris-Base，18.8gGlycine，5克SDS溶解定容至1000ml。1xSDS上样缓冲液：0.05MTris-HCL，100mM0-巯基乙醇，2%(m/V)SDS，0.1%(m/V)溴酚蓝，10%(V/V)甘油染色液：0.1%(m/V)考马斯亮蓝R-250，25%(V/V)甘油，10%(V/V)冰醋酸脱色液：10%(V/V)醋酸，5%(V/V)乙醇量取100ml醋酸、50ml乙醇溶于800ml超纯水中，定容至1000ml。实

10、验方法实验准备及样品处理：用自来水清洗烧杯、电泳仪及其配件，然后四蒸水冲洗干净，晾干备用，玻璃板先用自来水清洗，擦干，酒精棉球擦干，自然晾干备用。配胶：如表一所示，制15分离胶。制备方法如下：在烧杯中依次加入2.3ml超纯水、30%丙烯酰胺5ml、1.5MTris-CL2.5ml、10%SDS0.1ml、10%APS0.1ml，最后添加TEMED0.004ml。加入TEMED混合均匀后，立即用吸管加入胶板中(倒胶时，以梳子齿端为参照，预留1cm浓缩胶空间)。然后，胶上加满蒸馏水封闭，以防蒸发。分离胶室温30min左右即可完全凝固。5%浓缩胶：烧杯中依次加入合适量的超纯水2.1ml、30%丙烯酰

11、胺0.5ml、0.5MTris-CL0.38ml、10%SDS0.03ml、10%APS0.03ml，先将分离胶上的超纯水倒掉，并用滤纸小心吸干残留水分，此时再将TEMED0.003ml加入烧杯中，混合均匀立即用移液枪滴加到分离胶上，插入合适的梳子。积层胶20min左右可完全凝固。表1：尿素-SDS法制胶配方成分分离胶15%浓缩胶5%超纯水(ml)2.32.130%丙烯酰胺(ml)5.00.51.5MTris-CL(ml)2.50.5MTris-CL(ml)0.3810%SDS(ml)0.10.0310%APS(4C)(ml)0.10.03TEMED(4C)(ml)0.0040.003尿素(g

12、)3.61.3.3加样：小心拔掉梳子，组装好电泳仪。然后倒入lxRunningBuffer。将蛋白Marker和处理好的样品按顺序加入胶孔，并做好记录。1.3.4跑胶：加样完毕即可跑胶，可固定电压进行跑胶oBio-Rad电泳仪可固定在200V,君意电泳仪固定在150V,当染带刚刚跑出胶板时，跑胶完成。1.3.5卸胶：小心拆卸胶板，用分离器小心将两层玻璃板分离，切去积层胶。1.3.6染色：将分离胶放于染色盒中，倒入20ml染色液，然后一起放在摇床上，慢慢摇动。染色20min即可。1.3.7脱色：将分离胶取出，放于脱色盒，倒入30ml脱色液，然后放在摇床上慢慢摇动过夜,或随时观察，直至分离胶除有蛋

13、白的地方为蓝色其余部分变为无色即可。1.3.8小分子多肽样品中蛋白迁移率的测定及其分子量的计算用倍率计读出照片上各样品色带中心与溴酚蓝前沿的距离，按标记变化比率换算出实际尺寸进行计算。电泳迁移率为Rf,即样品迁移距离与溴酚蓝迁移距离的比值。以标准组多肽的迁移率为横坐标，以其对应的分子量对数为纵坐标作图，经线性回归计算，得到标准曲线。然后根据未知样品的迁移率在曲线上查出其对应的分子量。2结果与分析2.1小分子多肽样品的尿素-SDS结果花97.4KD*66.2KD/3.0KD*31.0KD*20.1KD.144KD图1小分子多肽的尿素-SDS蛋白电泳结果1:阴性对照；2：小分子蛋白样品结果；M：低

14、分子量蛋白Marker由图可知，小分子蛋白样品中蛋白浓度较高，SDS电泳结果显示，蛋白大小处于14.4KD以下，样品纯度较高，无其他蛋白杂带，阴性对照无特定条带。2.2不同稀释浓度小分子多肽样品的尿奏SDS结果通过10倍稀释小分子多肽样品，进行尿素-SDS电泳，图2显示获得了较好的结果,从A1到A5,小分子蛋白样品浓度逐渐降低，呈现较好的规律变化。2.3尿素-SDS中蛋白条带迁移率及分子量标准曲线的绘制表1尿素-SDS中蛋白条带迁移率的测定项目数值Mr97.4KD66.2KD43.0KD31.0KD20.1KD14.4KDRf048.1111420Y21.7923921.602061.4771

15、211.3802111.146128注：A为标准品各条带对应的分子量；Rf为标准品各条带的迁移率测定值；Y为迁移率的对数值图3标准曲线的建立由表1中的数据绘制完成可进行测定小分子蛋白分子量的标准曲线，如图3所示，其中相关系数R20.99，表明建立的标准曲线可以用来测定小分子多肽的分子量。2.4小分子多肽样品中蛋白迁移率的测定及其分子量的计算测定尿素-SDS电泳中小分子多肽样品的迁移率为23.5,将此数值带入到分子量测定标准曲线方程中，计算得到待测小分子多肽样品的分子量为9.212977277KD。3讨论随着生物活性多肽物质的发现和多肽类药物的研制，小分子多肽电泳变得越来越重要已成为生物活性物质

16、纯化分析过程中不可缺少、经常使用的快速鉴定方法。凝胶电泳以其操作简单、分辨率高等优点而广泛应用于蛋白质Mr的测定。蛋白质Mr的测定通常采用非连续的SDS缓冲系统，缓冲液采用Tris-HCl；而多肽Mr的测定，采用Tris-Tricine缓冲液，可使小Mr多肽在浓缩胶中有效地浓缩，从而提高分辨率。SDS的有效分离范围取决于聚丙烯酰胺的浓度和交联度，其孔径随着双丙烯酰胺：丙烯酰胺比率的增加而减小Mr低于10000的小分子肽，即使用较高浓度的聚丙烯酰胺凝胶的SDS也不能完全分离。本研究建立的双层胶尿奏SDS测定小分子多肽Mr的方法有以下优点：(1)操作简便。将常规的3层胶改为2层胶(分离胶和浓缩胶)

17、；浓缩胶与分离胶采用了同一缓冲体系，简化了操作步骤，减少了由于凝胶制备而引起的诸多影响电泳的因素；(2)分辨率高。将3层胶改为2层胶后，分离胶的有效长度增加，可使单位凝胶长度下容纳的电泳条带数增加从而使分辨率提高；(3)成本低。替代了昂贵的Tris-Tricine缓冲系统，电极缓冲液可以重复利用；(4)电泳时间短。由原来56h缩短为2.5h，达到了快速检测目的。我们用含6mo1Lt尿素的SDS方法，不需银染而直接用考马斯亮蓝R2250染色1.52h,即可把标准品中的条带显示清楚，且简单方便，实验范围内多肽Mr的对数与迁移率呈良好的线性关系，相关系数r2达到0.9938。该方法的建立为小分子多肽

18、分子量的估算提供了一种较好方法。参考文献张龙翔生化实验方法和技术M.北京:教育出版社,1982.郭晓君.SDS电泳技术的实验考虑及最新进展J.生物化学与生物物理进展,1991,18:32-37.C1eve1andDW,FischerSG,KirschnerMWeta1.Peptidemappingby1imitedproteo1ysisinsodiumdodecy1su1fateandana1ysisbyge1e1ectrophoresisJ.JBioChem,1977,252(3):1102-1106.SchabggerH,JagowG.Tricine-sodiumdodecy1su1fate-po1yacry1amidege1e1ectrophoresisfortheseparationofproteinsintherangefrom1to100KDaJ.Ana1Biochem.1987,166:368-379.邹毅，祝沛平，赵晓丽等用一