第20讲第四章细胞工程制药(1)ppt课件

1、第四章 细胞工程制药细胞工程概说细胞技术在生物制药中的运用.细胞工程概说细胞工程的定义与内涵动物细胞工程及特点植物细胞工程及特点细胞固定化技术与细胞反响器.细胞工程的定义与内涵细胞工程Cell Engineering，也称细胞技术，是生物工程的主要内容之一。它是指运用现代细胞生物学、发育生物学、遗传学和分子生物学的实际与方法，按照人们的需求和设计，经过细胞交融、核质移植、染色体移植以及组织和细胞培育等方法，快速繁衍和培育出人们所需求的新物种的生物工程技术。按照定义，发酵技术也属于细胞工程的范畴。由于发酵过程本身就是一个大规模微生物细胞培育技术，或者说所谓动植物细胞培育技术正是自创了传统发酵技术

2、而开展起来的。.细胞工程的定义与内涵细胞操作技术细胞交融细胞核移植细胞器移植染色体添加外源染色体导入胚胎移植细胞培育组织培育.细胞交融在自发或人工诱导下，两个不同基因型的细胞或原生质体交融构成一个杂种细胞。根本过程包括细胞交融构成异核体、异核体经过细胞有丝分裂进展核交融、最终构成单核的杂种细胞。有性繁衍时发生的精卵结合是正常的细胞交融，即由两个配子交融构成一个新的的二倍体。 .细胞核移植所谓细胞核移植技术，就是将供体细胞核移入除去核的卵母细胞中，使后者不经过精子穿透等有性过程即无性繁衍即可被激活、分裂并发育成新个体，使得核供体的基因得到完全复制。以供体核的来源不同可分为胚细胞核移植与体细胞核移

3、植两种。1 供体核的获得2 受体细胞的获得及其去核3 核卵重组4 细胞交融/激活5 重构胚的培育与移植.细胞器移植细胞工程的一项技术，将一个物种的细胞器分别出来，经过与另一物种的原生质体混合培育及原生质体的包饮作用，把细胞器摄入到细胞内，进展作物的遗传改良，目前研讨较多的主要是叶绿体的摄入。显微操作技术是指在高倍复式显微镜下，利用显微操作器micromanipulator进展细胞或早期胚胎操作的一种方法。显微操作器是用以控制显微注射针在显微镜视野内挪动的机械安装。显微操作技术包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切割等。.染色体添加染色体工程chromosome enginee

4、ring按设计有方案削减、添加和代换同种或异种染色体的方法和技术。也称为染色体操作。它不仅在改良植物的遗传根底培育新种类上遭到注重，而且也是基因定位，和染色体转移等根底研讨的有效手段。.胚胎移植胚胎移植又称受精卵移植，俗称人工授胎或借腹怀胎，是指将雌性动物的早期胚胎，或者经过体外受精及及其他方式得到的胚胎，移植到同种的、生理形状一样的其他雌性动物体内，使之继续发育为新个体的技术。胚胎分割移植是指采用机械方法将早期胚胎切割成2等份、4等份或8等份等，经移植获得同卵双胎或多胎的技术。.细胞培育原代培育是指从供体内取出组织后，经机械以及消化分别成单个细胞或单一型细胞群，使之在体外模拟人体生理环境，在

5、无菌、适当温度和一定的营养条件下，生存、生长和繁衍。传代培育原代细胞培育胜利以后，需求进展分别培育，否那么细胞会因生存空间缺乏或密度过大，营养妨碍，影响细胞生长。细胞由原培育瓶内分别稀释后传到新的培育瓶中培育的过程称之为传代培育。传代细胞允许培育的细胞扩增(构成细胞株)，可以进展细胞克隆，易于保管，但能够丧失一些特殊的细胞和分化特征。.组织培育在无菌的条件下，将植物的器官或组织的一部分切下来，放在适当的人工培育基上进展培育，这些组织器官就会进展细胞分裂，构成没有分化的一团薄壁细胞，叫愈伤组织。在适宜的光照、温度和一定的营养物质与激素的条件下，愈伤组织开场分化，发育成一棵完好的植株。 .动物细胞

6、工程及特点动物细胞构造及生理特点没有细胞壁成熟细胞难以脱分化分裂周期长：1248h贴附生长，接触抑制寿命有限：普通在50代左右环境敏感培育条件要求高：细胞生长因子培育工艺不同于微生物或植物细胞.动物细胞工程及特点动物细胞培育的根本程序.动物细胞工程及特点动物细胞系1原代细胞系直接取自动物组织、器官，经过粉碎、消化而获得的细胞。2二倍体细胞系是原代细胞经过传代、挑选、克隆，从多种细胞成分的组织中挑选出来的具有某种特征的细胞株。3延续细胞系是从正常细胞转化而来，分化不成熟的、获得了无限增殖才干的一种细胞。4基因工程细胞系经过基因工程技术，把编码蛋白质的基因在分子程度上进展设计、改造、重组， 所获得

7、细胞系。冷冻保管液氮温度196，保管10年以上。7080保管细胞，短期内对细胞的活性无明显影响，但随着冻存时间延伸，细胞存活率明显降低。400范围内保管细胞的效果不佳。 .动物细胞工程及特点动物细胞培育基的组成及常用培育基常用成分有：1氨基酸2维生素。最低根本培育基只含B族维生素，其它都靠从血清中获得。3无机盐4葡萄糖5激素和生长素。普通加血清即可满足需求，常用的有小牛血清、胎牛血清、人血清等。.动物细胞工程及特点常用培育基：1天然培育基主要有生物性体液如血清、组织浸出液如胚胎浸出液、水解乳蛋白等。2合成培育基根据天然培育基的成分，用化学物质对动物体内生存环境中各种知物质在体外人工条件下的模拟

8、，经过反复实验挑选、强化和重新组合后构成的培育基。3无血清培育基无血清培育基普通是由根底培育基和替代血清的补充因子所组成。.动物细胞工程及特点培育条件1温度昆虫细胞培育温度普通2528，哺乳动物细胞的培育温度普通37。2pH动物细胞培育适宜的pH普通在7.27.4，低于6.8或高于7.6都不利于细胞生长，严重时会导致细胞死亡。3溶氧及气体环境培育初期要求较低的溶氧程度，对数生长期或培育后期，溶氧程度要求添加。除了氧气供应外，还应留意培育基的氧气和CO2的平衡。4浸透压大多数动物细胞对浸透压的忍受程度较强，只需浸透压变化不很猛烈，普通对培育物不会呵斥致命损伤。动物细胞浸透压的维持普通采用平衡盐溶

9、液。 .动物细胞工程及特点动物细胞培育技术1灌注悬浮培育2贴壁细胞培育3固定化细胞培育.灌注悬浮培育悬浮培育是指细胞在培育器中自在悬浮生长的培育方法，它是在微生物发酵的根底上开展起来的一种动物细胞培育技术。非贴壁依赖性细胞如血细胞、淋巴细胞、某些肿瘤细胞包括杂交瘤细胞以及某些转化细胞，可以采用此法进展培育。.贴壁细胞培育贴壁细胞培育指必需将细胞贴附在固体介质外表上才干进展细胞培育的方式，主要用于非淋巴组织等贴壁依赖性细胞的培育。培育时，在固体载体外表上生长并扩展成一单层，所以又称为单层培育或微载体系统培育法。由于大部分动物细胞无细胞壁，属于贴壁依赖性细胞，所以贴壁培育是动物细胞培育的一种重要方

10、法。 .固定化细胞培育固定化细胞培育是指将细胞限制或定位于特定空间位置的培育技术。采用载体使整个细胞固定化。常见的固定化培育是包埋培育，常用凝胶海藻酸钙、琼脂糖、血纤维蛋白等来包埋细胞，能使细胞处于活性形状进展培育。.植物细胞工程及特点植物细胞的培育特性1、细胞个体较大较微生物细胞大的多，有纤维细胞壁，细胞抗剪切力差；2、细胞生长速度较慢，容易被微生物污染，培育时需添加抗生素；3、细胞培育过程中易聚集成团，较难进展悬浮培育；4、培育时需供氧，但培育液黏度较大，不能耐受强力通风搅拌；5、植物细胞具有群体效应及解除抑制性；6、细胞培育产物滞留于细胞内，产量低；7、植物细胞具有构造和功能全能性。 .

11、植物细胞工程及特点培育基组成1根本培育基根本培育基的各种成分是愈伤组织和悬浮细胞培育的物质根底，尤其在稳定期次级代谢产物累积时更是如此。2碳源碳源通常以光自养培育中的CO2或异养培育中的糖类两种方式提供，其性质和数量往往对培育细胞的生物量有很大的影响。CO2可以诱导某些特征反响，如在金苹果的悬浮细胞培育中，高浓度CO2可产生一种特有的苹果香味。植物细胞培育中运用最多的碳源是糖类，对次级代谢产物的影响主要取决于所运用的糖类的种类及细胞次级代谢产物的生物合成过程。.植物细胞工程及特点3植物生长调理剂植物生长调理剂在植物细胞培育中起着非常重要的作用，能够是关键性的。但是植物资料和生理形状的差别，无一

12、定的规律可循，必需经过仔细的实验察看才干确定其适宜的数量和种类。与植物细胞培育和组织培育有关的主要激素：IAA、GA、CTK4诱导子消费某些植物次级代谢物质需求刺激性物质。植物抗毒素phytoalexins是指在植物防御系统内能对抗微生物进攻的某些次级代谢产物根据其功能又称为“后感染防御物质。虽然在有些情况下代谢产物能够会延续合成，但在另外一些情况下只需细胞被刺激时才干产生植物抗毒素，或仅在被诱导时其产量才干添加。.植物细胞工程及特点植物细胞培育技术培育罐类型、通气、搅拌和培育方法等。1、培育容器小规模实验室培育所用的培育容器50500ml具有较高的氧转移率，经过简单的定期搅拌，培育物的每个部

13、位均可得到比大规模培育更好的氧供应。工业化消费一切培育容器就是大型发酵罐500L以上。.植物细胞工程及特点2、培育方法单细胞培育从植物组织器官分别得到单细胞，在特定条件下可以构成具有不同性状的愈伤组织细胞系，或者发育成完好的植株试管苗。悬浮细胞培育是指单细胞或小的细胞团块悬浮于培育液中进展生长的过程。主要用于代谢物的消费，如属于次级代谢物质，那么需加中间体或诱导子等。大规模细胞培育类似于微生物发酵的培育过程，其产物可以是细胞，也可以是代谢产物初级、次级产物。固定化细胞培育与前述一样，是将细胞包埋在固体资料中，细胞坚持活性。下面将详细讨论。.细胞固定化技术与细胞反响器一固定化细胞技术利用物理或化

14、学的手段将游离的细胞定位于限定的空间区域，并使其坚持活性并可反复运用的技术称为细胞的固定化，该细胞称为固定化细胞。固定化细胞有如下几方面的优点：它不需进展破碎细胞而直接利用胞内酶，降低了制备本钱；酶在细胞内的环境中比较稳定，酶活力的损失较少；边参与培育基，边排出产物，能有效地防止反响抑制和产物耗费；适宜于进展多酶顺序延续反响；易于进展辅助因子的再生，因此更适宜于需求辅助因子的反响。 .细胞固定化技术与细胞反响器细胞固定化方法吸附法共价结合法交联法包埋法1.离子结合 2.共价结合 3.交联 4.聚合物包埋5.疏水相互结合 6.脂质包埋 7.微胶囊 .细胞固定化技术与细胞反响器细胞反响器利用细胞和

15、酶等生物功能进展化学反响的系统，称为生物反响器，分别称为细胞反响器和酶反响器。微生物发酵安装是典型的生物反响器，从广义的概念来讲，一个摇瓶如三角瓶和一个摇瓶机的结合，就可称为一个生物反响器。现代生物反响器的设计思想是把从初级原料到最终产物这中间的众多工艺流程全部串联在一个生物反响单元系列里，构建成一个体积适中的新型反响器。高度自动化是生物反响器的另一重要特点。发酵过程中的一些重要参数的信号，必需经过一种媒介安装传送到反响器外部，反映到检测仪上，这种安装称为生物传感器，它起到传送信号的作用。 .思索题1、细胞工程的概念与研讨内容。2、简要阐明动、植物细胞工程异同点。3、细胞固定化技术的根本要点。

16、4、什么是生物反响器？.植物细胞全能性植物的每个细胞都包含着该物种的全部遗传信息，从而具备发育成完好植株的遗传才干。在适宜条件下，任何一个细胞都可以发育成一个新个体。植物细胞全能性是植物组织培育的实际根底。.植物细胞培育基常用的培育基有几十种。如MS下表、B5、E1、N6培育基等。其中以MS、B5等运用较为广泛。 大量元素(20) 用量(mg/L母液)微量元素(200)用量(mg/L母液)NH4NO333000KI166KNO338000H3BO31240CaCl22H2O8800MnSO44H2O4460MgSO47H2O7400ZnSO47H2O1720KH2PO43400Na2MoO42H2