分子神经生物学课后作业(刘缨老师)(共8页)

1、分子神经生物学课后作业（刘缨老师）第 页读书(d sh)报告标题(biot)：Intrinsic transition of embryonic stem-cell differentiation into neural progenitors （胚胎干细胞分化(fnhu)为神经前体细胞的本征跃迁）杂志：Nature （类型：Article）发表日期：2011年2月24 日通讯作者：Yoshiki Sasai（笹井芳树）作者简介：笹井芳树*（1962-2014），干细胞生物学家，日本神户市理化研究所（RIKEN）发育生物学中心（CDB）副主任，再生医学领域世界级学者，使用ES细胞、诱导多功能干

2、细胞（iPS细胞）治疗眼部疾病的日本国家级项目负责人。文章核心： 发现锌指核蛋白Zfp521是驱动小鼠ESCs本征神经分化的重要分子。主要内容： 哺乳动物中，胚胎干细胞本征分化形成神经系细胞的机制一直不清楚。本文研究发现锌指核蛋白Zfp521是驱动小鼠ESCs本征神经分化的重要分子。在缺少神经分化抑制分子BMP4情况下，Zfp521在不同的分化的ESCs中强烈的表达。而且强制表达Zfp521能够让ESCs在BMP4存在的情况下仍然发生神经转变。相反，在差异化培养下，Zfp521的ESCs没有进行神经转化，而是倾向于停留在外胚层的状态。Zfp521 通过与辅激活子p300作用直接激活早期的神经的

3、基因。因此，ESCs分化的跃迁从上胚层状态到神经外胚层前体细胞特异地依赖于细胞本征的表达和激活子Zfp521的功能。一、研究(ynji)背景及意义： 神经化命运通常被认为是胚胎干细胞（ESCs）分化的本征方向决定的，但是在缺少(qusho)外在诱导信号情况下让非分化细胞接受这样的神经化命运的细胞内机制尚不清楚。之前的研究报道：对于脊椎动物（特别是对两栖类的研究）从一个未指定的胚胎外胚层细胞进行神经分化是通过一个细胞本征的机制及缺少相应的神经分化抑制信号分子（比如BMP4），但是这个本征机制的最初步骤的细节(xji)，特别是在哺乳动物中，了解的很少。 本研究对哺乳动物从ESCs到胚胎外胚层细胞进

4、行的神经分化这一细胞本征的机制进行探索，并对相应的参与神经分化过程的信号分子进行寻找，为哺乳动物胚胎干细胞本征分化形成神经系细胞的机制提供了科学的解释和合理的模型。 本研究的实验思路、实验设计和实验结果的分析和实验方法的采用都很有想法，可以作为以后相关领域研究的参考。二、研究基础：ESCs的体外培养技术已经很成熟，它为研究哺乳动物发育的初级调控步骤提供了一个通用的实验系统，为寻找神经命运过程中的信号分子提供了可行性。之前的研究已经建立了小鼠和人的ESCs的体外神经分化的有效研究平台，能实现生长因子最小化的悬浮培养（即SFEB培养）三、研究方案及内容： （1）Zfp521诱导神经转变 筛选基因（

5、GeneChip-based法） 用基于表达谱的多重样本比较算法和之前的研究，初步筛选出与诱导神经分化相关(xinggun)的基因，共104个基因 进一步筛出29个基因(jyn)cDNA克隆，脂质转染到mESCs, 在含有FCS（抑制剂）条件下培养 最终找到1个基因表现(bioxin)出最强的诱导效应，即Zfp521. 实验表现：Zfp521的表达在SFEB培养的前5天里增加了60倍。问题：在过量的FCS和BMP4条件下Zfp521的表达显著下降。Zfp521的强制表达 表现：在SFEB培养条件下，Zfp521的强制表达增强了Ncad的表达，然而，加入BMP4抑制了Ncad的表达。 推论：Zf

6、p521的神经化活动可能覆盖了BMP4的抑制效应。 原位杂交分析 表现：在小鼠的早期胚胎中没有检测到Zfp521的大量表达，但在原肠胚形成以后，检测到其强烈的表达信号。 推论：Zfp521是一个能强烈促进神经分化的早期的神经核蛋白。Zfp521在什么发育阶段起作用Zfp521、BMP4有什么关系Zfp521的表达如何如何得到相关基因提出问题原位杂交强制表达筛基因SFEB培养实验设计在小鼠的早期胚胎中没有检测到Zfp521的大量表达，但在原肠胚形成以后，检测到其强烈的表达信号。初步筛出104个基因20个基因Zfp521Zfp521的强制表达增强了Ncad的表达，加入BMP4抑制了Ncad的表达Z

7、fp521的表达在SFEB培养的前5天里增加了60倍结果表现Zfp521的神经化活动可能覆盖了BMP4的抑制效应Zfp521是一个能强烈促进神经分化的早期的神经核蛋白Zfp521可能是神经分化过程中的诱导因子Zfp521可能是诱导分化的激活因子 推 论 图一 Zfp521诱导神经(shnjng)转变实验设计的思路 （2）本征分化(fnhu)的需求 shRNA 实验(shyn) 提出问题：是否Zfp521对mESCsde 神经分化产生作用？ 已有知识：Zfp521的shRNA不仅能强烈抑制Zfp521的作用，而且还能抑制其他早期其他信号分子，如Sox3、Ncad等。 实验设计：ESCs 的SFE

8、B培养（对照组和带有Zfp521的shRNA实验组）、共聚合培养及相关的rescue实验。（用qPCR和流式细胞技术验证）。 结果及推论：对于mESCs的神经转变，Zfp521的表达是必要而且足够的。 囊胚注射实验用对照组和Zfp521敲除的ESCs做囊胚注射实验实验表现：对照组：子代表现出大量的神经胚胎组织 实验组：没有发现任何喙状的神经管组织。 推论：进一步说明了Zfp521对于个体的神经组织形成是至关重要的。从外胚层到神经外胚层的转变 存在矛盾：Zfp521的过表达没有在抑制剂SU5412下发挥诱导作用。 提出问题：Zfp521既然不是唯一的神经分化激活分子，那么它主要是作用在分化过程的

9、哪一步呢？ 实验设计：分析Zfp521缺失后，对每一步表达的影响（标记，免疫染色）。 结果及推论：缺少Zfp521使得MESCs只能分化到类外胚层细胞，而不能继续(jx)分化为神经外胚层细胞。继续提出问题：mESCs缺少像Zfp521这样的因子后是否会向会想非神经世系(shx)转变？实验设计：qPCR分析(fnx)，免疫染色等等。总的结论：在神经外胚层的分化不同阶段，Zfp521是选择性的被使用的。（4）Zfp521对早期神经基因的反式激活 提出问题：现在需要了解 Zfp521功能的分子模型。Zfp521是通过优先地与神经基因位点结合发挥功能，还是与非神经的作用发挥功能？ 实验设计：用ChIP

10、 assay 检测SFEB培养表达带有标记的Zfp521的mESCs。 结果及推论：Zfp521蛋白优先地与神经基因位点结合发挥功能，而不是与非神经的基因位点。 进一步推论：Zfp521通过促进早期的神经外胚层基因促进神经分化，而不是一直非神经的基因的表达。 意外发现：实验过程中发现p300的单独强制表达促进了ESCs的神经分化。（5）提出本征神经分化的模型图二 基于Zfp521的本征神经分化(fnhu)模型示意图 当ESCs到达明确的外胚层阶段时，Zfp521开始表达，诱导ES细胞本征的神经(shnjng)分化； 一旦Zfp521表达，尽管抑制剂BMP4存在(cnzi)，也会导致ESCs的神

11、经转化；说明Zfp521的抑制作用存在于BMP4信号的下游通路； 与辅激活剂p300一起，zfp521直接作用于早期的神经外胚层基因Sox3(或者Sox1、Sox6)；Oct6的表达增强了Zfpy521的表达。 总结：Zfp521的细胞本征激活和通过BMP4的负调节形成了ESCs对于神经外胚层细胞的本征转变这一调控网络的核心结构。 四、结果（1）发现锌指核蛋白Zfp521是驱动小鼠ESCs本征神经分化的重要(zhngyo)分子。 在缺少(qusho)神经分化抑制分子BMP4情况下，Zfp521在不同的分化的ESCs中强烈的表达；而且强制表达Zfp521能够让ESCs在BMP4存在的情况下仍然发

12、生神经转变。在差异化培养下，Zfp521的ESCs没有进行神经(shnjng)转化，而是倾向于停留在外胚层的状态。Zfp521 通过与辅激活子p300作用直接激活早期的神经的基因。ESCs分化的跃迁从上胚层状态到神经外胚层前体细胞特异地依赖于细胞本征的表达和激活子Zfp521的功能。Zfp521的细胞本征激活和通过BMP4的负调节形成了ESCs对于神经外胚层细胞的本征转变这一调控网络的核心结构。 五、创新点发现一个新的参与哺乳动物ESCs本征神经分化的重要分子：锌指核蛋白Zfp521。关于神经分化的本征机制之前的研究主要是在两栖类，比如Xenopus，此研究是基于小鼠（哺乳动物）胚胎干细胞对神

13、经外胚层细胞的本征转变的研究，不论是研究难度和创新度都是很高的。（3）本研究很好的运用了SFEB培养法，虽然该方法不是此次研究的首创，但是该研究很聪明的使用了该培养法，从而在基因的筛选、表达量的测定、以及后续的解开信号分子间的关系试验中得到科学正确的实验结果。（4）shRNA的使用时本文的另外一个亮点。由于之前的研究已经清楚Zfp521的shRNA不仅能强烈抑制Zfp521的作用，而且还能抑制其他早期其他信号分子，如Sox3、Ncad，但是很少有研究将这个想法使用在神经分化的课题上，也是基于采用了对于shRNA，才得出：mESCs的神经转变，Zfp521的表达是必要而且足够的，这样的精确的结论

14、。（5）本研究的另一个创新点是在实验过程中发现p300的单独强制表达促进了ESCs的神经分化。 六、问题(wnt)（1）文章提到，Zfp521的过表达没有在抑制剂SU5412下发挥诱导作用，是否说明文章提出(t ch)来的Zfp521激活作用和BMP4的负调节只是一条ESCs对于神经外胚层细胞的本征转变的其中一条通路？或者说该研究的结果只适用于解释文中介绍的因子存在的环境。本文对于这一点没有作解释。（2）在Zfp521对早期(zoq)神经基因的反式激活实验中，用Sox1、Sox和Sox6三个基因来说明Zfp521与神经基因发挥正效应互作，没有问题；但是在排除“Zfp521是与非神经的基因作用发挥功能”这一点时，作者只采用了Oct6、Fgf5、Klf4和Rex1四个标记基因，我认为有点不够。感想 本文很完整地展示了一个生物学问题研究的基本过程，每个实验设计都有理有据，而且每个小的试验里面都是一个很缜密的思维模式：提出问题1实验设计1实验表现1推论1提出问题2实验设计2（见图一 Zfp521诱导神经转变实验设计的思路），五个大的试验框架里面都是许多逻辑性很强的小的试验连接而成，思路明确。可以作为以后写文章做研究的借鉴。本文的研究后期，作者在试图寻找Zfp421 分子功能的模型的时候，提出了一个问题：Zfp521是通过促进早期的神经外胚层基因促进神经分化