血管新生与干细胞移植在下肢缺血中的实际应用

1、血管新生与干细胞移植在下肢缺血中的实际应用第一部分，干细胞研究和应用的基础知识概念干细胞(stem cell)是指具有无限或较长期的自我更新能力，并能分化出至少一种高度分化子代细胞的细胞。根据细胞来源将干细胞分成胚胎性干细胞和成体干细胞，而成体干细胞包括自体干细胞和异体干细胞。 干细胞移植的类型（1）1、根据其分化潜能的宽窄将干细胞分类： （1）全能干细胞 (totipotent stem cells)， （2）三胚层多能干细胞(pluripotent stem cells)， （3）单胚层多能干细胞(multipotent stem cells)和 单能干细胞(monopotent stem

2、 cells)。 干细胞移植的类型（2）（1）全能干细胞 (totipotent stem cells)： 哺乳动物的生命周期始于受精卵，受精卵具有分化成体内200多种不同细胞类型的潜能，并能发育成为一个完整个体，细胞的这种潜能称为全能性，相应地，具有这种潜能的细胞则称为全能干细胞。（2）多胚层多能干细胞： 内细胞团细胞虽然失去了发育成完整个体的能力，但仍具有分化成个体中包括生殖细胞在内的各种细胞的潜能，具有这种潜能的细胞称为多胚层多能干细胞 干细胞移植的类型（3）（3）单胚层多能干细胞： 其分化潜能较前两者要窄许多，它只能分化成几种特定类型的细胞，如间充质干细胞通常只能分化形成骨、肌肉、软骨

3、、脂肪及其他结缔组织。却不能分化为除此以外的其他组织。（4）单能干细胞： 有的干细胞只分化成单种细胞，如神经元干细胞只能分化成神经元，而不能分化为显形胶质或少突胶质，这种细胞称为单能干细胞。 干细胞移植的类型（4）2、根据细胞来源将干细胞分成胚胎性干细胞和成体干细胞。 （1）胚胎性干细胞： 胚胎性干细胞通常是指源自囊胚内细胞团的ES细胞(embryonic stem cells)，但通常人们将从畸胎癌中分离出来的EC细胞和从早期胎儿原始生殖细胞中分离、筛选到的EC细胞也归为胚胎性干细胞。 干细胞移植的类型（5）（2）成体干细胞：指那些组织或器官特异性干细胞，它们主要用于维持细胞功能的稳态，早先

4、人们认为在一些经常更新的组织，如血液、小肠黏膜、表皮等中才存在着干细胞，这些干细胞负责机体的更新与创伤的愈合，但近年来的研究结果表明一些曾认为成熟后不再进行分裂的组织，如脑、肝中也存在着干细胞。 成体干细胞来源 目前发现有干细胞存在的组织类型也越来越广泛，这些组织包括：骨髓、外周血、脑、血管、骨骼肌、肝、胰、皮肤和胃肠道的上皮及脂肪等。其来源 有2种说法：A、一种是成体干细胞是在个体发育过程中残留下来的胚胎干细胞；B、另一种是成体干细胞是成体细胞在某些情况下(如外伤等)经过重新编程(reprogmmming)后形成的，甚至是细胞间自发融合的结果。 究竟哪种说法是正确的？还有待于进一步的研究证明

5、。人们的选择目前由于各国对胚胎干细胞的伦理道德的争论，限制了胚胎干细胞的基础研究和临床应用前景，因此研究比较多的是成体干细胞。异体干细胞的免役排斥问题无法得到解决，而自体干细胞移植是采用患者自身的干细胞。 自体干细胞移植有2个优点1、不存在异体干细胞的免役排斥；2、没有胚胎干细胞的伦理道德问题。此外，还具有取材方便的特点。因此，目前自体干细胞移植治疗疾病呈现出广阔的应用前景。血管新生的类型血管新生（neovasculogenesis）：1、血管生成（angiogenesis）2、动脉生成(arteriogenesis) 3、血管形成血管发生(vasculogenesis)血管生成（1）指源于毛

6、细血管后微静脉，以“出芽”方式新生毛细血管。在成体，主要由组织缺氧诱导低氧诱生因子（HIF）-1表达，再由后者活化包括血管内皮生长因子（VEGF）、VEGF受体1（flt-1）和血管生成素-2等诸多基因的转录而来。 血管生成（2）在健康个体，血管生成主要局限于以下四种情况： 月经周期中的子宫内膜生成； 妊娠期时的胎盘形成； 急性创伤后的伤口肉芽生长； 毛发生长初期的毛囊血管化。 动脉生成指血管造影可以鉴别的足够管径的侧枝循环的成熟或新生。它通常发生在局部缺血组织之外，与动脉狭窄局部剪切应力变化导致的血液中单个核细胞的聚集有关。目前对其认识尚不深刻，似乎与一系列生长因子包括成纤维细胞生长因子（F

7、GF）、血小板源性生长因子（PDGF）、VEGF和CXC细胞因子的释放有关。 血管形成（1）则是指由循环血管内皮祖细胞（EPCs）和血管前体细胞在原位形成新生血管的过程。传统认为血管形成只局限于胚胎发育时期，直到1997年，Asahara等发现纯化的CD34+造血干细胞能在体外分化为有内皮细胞表型的细胞并将其称之为EPCs，这一“认识”才被翻转。 血管形成（2）随着研究的深入，发现外周血中的EPCs有不同的来源： 造血干细胞中的部分细胞； 内皮细胞培养环境中的髓样细胞（CD14+/CD34-）； 其他循环中的前体细胞； 外周循环中成熟的内皮细胞。 根据这一异源群体的增殖特性和在血管新生中的作用

8、将其分为：早期EPCs，即来源于髓样细胞（单核-巨噬细胞系，CD14+）的循环成血管前体细胞，在血管新生中主要通过分泌生长趋化因子如VEGF、白介素-8（IL-8）和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）发挥作用。晚期EPCs,类同于前述的骨髓来源的循环内皮祖细胞，亦称outgrowth endothelial cells（OEC），具有强大的增殖潜能，通过直接参与血管新生并分泌MMP-2发挥作用。循环内皮细胞（circulating endothelial cells,CECs）,被认为是由血管内皮脱落的细胞，具有不同的增殖潜能。干细胞时代的到来1997-1998年间不少研究者发表了利用成人骨髓中

9、和外周血内CD34+细胞体外培养扩增出表达内皮标记的细胞，而且发现这些细胞能够掺入到缺血组织部位的新生血管中的研究报告。这些研究结果开启了应用“干细胞”移植促进血管新生，治疗血管闭塞症的时代。 目前的观点当组织因血管闭塞等原因发生缺血缺氧时，会上释放一系列细胞因子，促进EPC脱离与骨髓基质的联系，释放到外周血中。临床应用G-CSF或也能达到上述动员目的。 这些被动员出的和外周循环中已存在的一些列与血管新生有关的细胞在细胞因子的趋化作用下向血管损伤部位移行，归巢（home）到损伤部位，在细胞因子的作用下，发生增殖分化，修复损伤的血管内皮或形成新生血管。 不同细胞成份的功能也不同1、源于骨髓的早期

10、EPC在血管新生中可能起到初始的作用；2、循环内皮细胞（CECs）在外周血中的数量与血管损伤的严重程度相关，因此可作为预示疾病程度的生物指标；3、EOCs细胞通过其较强的增殖分化潜力修复损伤或新生血管；源于单核/巨噬细胞分化而来的内皮细胞具有较强的细胞因子生长因子分泌功能，促进血管新生细胞因子促进血管新生。问题出现上述研究成果为临床工作提示新的研究方向，究竟骨髓或外周血中的细胞中那些细胞成分对血管新生有更多的益处？1、他们的适宜数量是多少？2、哪些细胞组合能够最限度地发挥干细胞促进血管新生的作用？3、哪些混杂细胞则可能无效或有抑制作用？研究这些细胞成分和数量的有效搭配可能达到有效提高治疗疗效和

11、效率的目的。这也是干细胞研究的热点之一。细胞因子的作用在新生血管形成的过程中许多细胞因子如VEGF、SDF、PDGF和 hepatocyte growth factor起这非常关键的促进作用 。细胞因子的副作用比较大：基因重组VEGF已开始I期临床应用，证明有一定改善缺血部位血流灌注效果，但全身应用VEGF可引起高血压，浮肿等副作用。 将携带有VEGF基因编码的质粒直接注射到缺血部位肌肉中，可达到短时间表达并改善缺血部位血流灌注及缓解临床症状的效果。-这可能是条光明大道？ 细胞因子的作用 尽管目前对调控血管新生的细胞因子有了一定的了解，但仍非常局限。 实际上血管新生是极其复杂的和多因素影响的过

12、程，可以想象出在血管新生过程中，众多的细胞因子是在不同的阶段以不同的浓度和不同的组合发挥着精确的调控作用。 干细胞应用的意义目前研究发现：在高龄、糖尿病和动脉粥样硬化等病理状态下，EPCs的数量、对Stromal-derived factor-1 (SDF-1)反应性降低，EPCs特异分子如Flk-1, Flt-1, CD133和VE-cadherin的mRNA水平明显低于健康对照。这说明此类病人自发的血管新生潜能的降低，也为自体骨髓干细胞移植提供了一定的理论依据。治疗性血管形成1999年，Isner等提出了“治疗性血管形成”（therapeutic vasculogenesis）的概念，倡导

13、补充EPC数量来增加血管生长因子的作用底物，达到更好的血管新生效果，治疗缺血性疾病。这可以说是一个生理加强疗法。 相关临床治疗观察发现：尽管部分患者可获得较好的疗效，但仍有许多患者并未从治疗中获益；因此进一步寻找能够提示预后的临床和生物学指标对这项治疗的开展也有十分重要的意义。 研究的意义患者年龄，原发病的类型、病程、临床分期，糖尿病的胰岛素抵抗等临床指标和患者外周血中循环的EPC、CECs含量，细胞因子动员的效果等与预后的关系都尚未被明确；目前还发现许多细胞因子在不同患者和不同病患部位局部的含量存在极大的差异，因此进一步研究这些问题，不仅可能用以预测治疗效果，也可能提示治疗的个体化方案。目前

14、国内外的最新进展促使我们对“骨髓干细胞”移植血管新生的作用机理、机体内环境对干细胞疗效的影响以及转基因骨髓源干细胞的作用进行进一步的研究，以提高干细胞的治疗效果。我们在临床和动物实验中均发现：骨髓干细胞治疗肢体动脉缺血的疗效差异与植入细胞数量、类型、细胞存活效率以及病变区域的微环境有关。 干细胞移植促进血管新生治疗下肢缺血的研究 （1）与血管新生相关的干/祖细胞的定义和功能： 临床上的治疗过程中主要采集骨髓或外周血来源的单个核细胞进行移植，并认为其中的CD34+或CD133+/VEGF-R2+细胞为血管新生的干/祖细胞，但这类细胞的增殖分化功能、他们的归巢到血管损伤部位的能力以及达到治疗效果的

15、有效数量等都是尚未充分了解的内容。干细胞移植促进血管新生治疗下肢缺血的研究 （2）与血管新生相关的细胞因子的功能和协调作用： 目前已发现并初步应用于临床的细胞因子包括VEGF、SDF、PDGF和 肝细胞生长因子（HGF）等，但他们在临床治疗中的有效剂量、途径和相互协调或拮抗作用、以及应用在不同基础病患者的效果是否相同等等都是尚未解决的问题。干细胞移植促进血管新生治疗下肢缺血的研究 （3）不同基础病患者的机体内环境对干细胞移植治疗下肢缺血的影响因素： 目前干细胞移植治疗下肢缺血的I、II期临床观察主要研究这种治疗的安全性和初步的有效性,但针对不同基础病患,不同年龄、不同血管病理改变以及由此可能导

16、致的体内不同细胞因子浓度变化等等多因素对治疗效果的影响尚未有深入的了解。 第二部分，干细胞移植的临床应用一、自体骨髓干细胞临床研究内容1、缺血局部肌肉注射与血管腔内注射疗效的对比性研究-结果：2组无统计学差异。2、上述的治疗效果是不是干细胞的作用？-2种不同移植浓度移植后的对比性研究-单条下肢单个核细胞总数108时，大多数患者有效果；细胞总数105时，无效。3、自体骨髓干细胞血管腔内移植治疗严重下肢缺血对比研究-2组无明显差异。4、下肢缺血的不同时期对疗效的影响？-早期效果明显优于晚期。5、骨髓干细胞移植与外周血干细胞移植治疗下肢缺血的对比性研究。6、动员后骨髓干细胞移植治疗下肢缺血的临床研究

17、。7、外周血干细胞移植治疗下肢缺血的临床研究。8、自体干细胞移植治疗下肢缺血性疾病的中期疗效观察。干细胞的类型1、从细胞分化潜能的宽窄不同分类： （1）全能干细胞 ， （2）三胚层多能干细胞， （3）单胚层多能干细胞和单能干细胞。2、从细胞的来源不同分类： （1）胚胎性干细胞 （2）成体干细胞 干细胞移植的类型1、从细胞来源的个体不同分类：（1）自体干细胞移植（2）异体干细胞移植2、从细胞来源的位置不同分类： （1）骨髓血干细胞移植：包括单纯骨髓干细胞移植和骨髓刺激后的骨髓干细胞移植（改良的骨髓干细胞移植） （2）外周血干细胞移植 （3）脐血干细胞移植 （4）胚胎干细胞移植自体干细胞的获得方法

18、主要通过以下两种方法获取1、直接进行穿刺抽取骨髓血- 骨髓血干细胞移植2、通过动员骨髓干细胞进入外周血，再用细胞分离机将干细胞分离出-外周血干细胞移植骨髓血干细胞与外周血干细胞的步骤1、骨髓干细胞移植：直接从骨髓中抽取400ml骨髓血，在实验室里分离，然后再注射到缺血的部位。简便，但需要进行骨髓穿刺的有创操作，获得的干细胞量较少；2、外周血干细胞移植：首先用粒细胞集落刺激因子（G-CSF）刺激骨髓，将骨髓中的干细胞动员到外周血中，然后再通过细胞分离机与肢体血管连通可以从外周血中一次获得大量干细胞。骨髓血干细胞与外周血干细胞的优缺点比较整个过程操作步骤细胞数疗效并发症骨髓血干细胞移植简单要求较高

19、10970-85%较少外周血干细胞移植简单无特殊要求101080%左右较多-动员自体干细胞移植的方法目前我们应用3种方法 1、下肢缺血区域肌肉注射 2、下肢动脉腔内注射 3、下肢缺血区域肌肉注射+下肢动脉腔内注射临床主要适应证：1、各种原因导致的慢性下肢缺血性疾病影像学检查病变血管无流出道，无法行手术搭桥2、保守治疗无效3、尽管有较好流出道动脉，有搭桥成功可能，但是对于年老体弱，无法耐受手术打击的患者禁忌症1、控制不好的糖尿病病人;2、过去5年内明确有恶性疾病的患者或血中肿瘤标记物（AFP,CEA,PSA,CA19-9,CA125）水平明显升高者;3、严重心、肝、肾、肺功能衰竭或一般状况很差不

20、能耐受干细胞移植手术者；4、严重的全身感染者；5、目前仍在吸烟又不准备戒烟者；6、半年内有心肌梗死、脑梗塞病史者；7、主髂等大动脉闭塞者。临床观察有效性的主要指标和方法 1、临床症状-主观指标 （1）疼痛 （2）冷感 （3）麻木2、客观标准 （1）跛行距离 （2）患肢皮温 （3）经皮氧分压测定 （4）激光多普勒血流量 （5）踝肱指数 （6）血管造影 （7）溃疡面的变化 （7）截肢的平面 疼痛评分0分：无疼痛1分：偶有疼痛，被问及能回忆起2分：疼痛经常出现但能耐受，不需或 偶用一般止痛剂3分：经常用一般止痛剂4分：因疼痛影响睡眠，一般止痛药剂难以缓解 治疗前：（）分 治疗后：（）分感觉评分：0分

21、：无冷感1分：患者偶述受累肢体有发凉、怕冷的感觉2分：受累肢体经常有发凉、怕冷的感觉3分：受累肢体有明显的冷、凉感觉，需要采 用局部保温措施，症状能得到一定程度 的缓解4分：受累肢体有明显的冷、凉感觉，采用局 部保温措施，症状也无明显改善 治疗前：（）分 治疗后：（）分麻木的评分标准0分-0级：无麻木1分-1级：偶感轻度麻木2分-2级：经常有轻度麻木不适3分-3级：麻木感觉明显，但可以忍受4分-4级：麻木非常明显，难以忍受，严重影响日常生活。客观标准评价1、溃疡的分级0级：非开放性损伤；或并存有足部的变形或胼胝1级：浅表溃疡，周边部分或全部组织增厚2级：溃疡累及韧带、肌腱、关节囊或筋膜，未合并

22、脓 肿或骨髓炎3级：深在的溃疡合并有脓肿，骨髓炎或关节脓肿4级：足前部或足跟部的坏疽5级：整个足部的广泛的坏疽 治疗前（）分 治疗后（）分2、表皮温度检查红外线皮肤温度检查是一项简单、实用的评判局部组织血供的方法。常用患处与健处的表皮温度对比。3、经皮氧分压（TCPO2）全球通用的三大评估血管疾病金标准之一肢体缺血情况的定量评估直接反映血管向组织供氧情况评估组织存活率无创，低成本可重复使用丹麦雷度TCM400经皮氧监测仪 4、保护性温度觉局部皮肤凉热感觉检查水杯法：将水杯中分别倒入凉水和温水，然后用杯壁接触足部皮肤，评判患者的凉热感觉。Tip-Therm（Germany）凉热感觉检查器。一头为

23、金属凉感觉一头为聚脂温感觉定性检查5、保护性疼痛觉局部针刺痛、热痛检查临床上，常用比较尖锐的针头刺下肢和腿部的局部皮肤，以评判患者对疼痛的感觉。定性检查6、音叉震动感觉检查定性检查不足：不能消除因敲击轻重而带来的音叉震动大小误差7、CTA8、MRA核磁影像检查9、血管造影-DSA9、截肢平面：降低、创面愈合单个核的细胞数 总数 : 0.25 x109 2.3 x109 平均9 CD34(+) 细胞: 0.6 % 1.3%自体干细胞移植的历史1、2002年8月：Eriko Tateishi-Yuyama 等在国际上首次报道了应用骨髓单个核细胞移植治疗下肢缺血。(The lancet, vol 3

24、60.August 10,2002)2、2003年3月谷涌泉等首次应用自体骨髓干细胞移植治疗下肢缺血（中国实用外科杂志，2003；23（11）：670） 。3、2003年1月中国医学科学院血液病研究所首次开展了自体外周血干细胞移植治疗下肢动脉硬化闭塞症。4、2003年8月谷涌泉等首次完成了经皮穿刺动脉腔内自体骨髓干细胞移植移植治疗下肢缺血。治疗下肢缺血可能的机制1、直接提供了内皮细胞祖细胞；2、提供了很多有利于内皮细胞生长的因子和细胞生长所需要的基质环境；3、促进了血管侧枝的形成，从而改善了缺血的状况。存在的问题1、目前尚缺乏明确的机理；2、需要更多的手段去评估移植后的疗效；3、应当寻找更多的

25、方式提高疗效。自体外周血干细胞移植外周血干细胞移植的适应证 一、慢性下肢缺血病人，包括：1、有间歇跛行且静息状态下踝肱指数（ABI）；或已有静息痛、坏疽、溃疡者;2、保守治疗无好转且无动脉流出道不适合外科搭桥手术的病人;3、年老体弱无法耐受手术创伤者。二、糖尿病足神经病变禁忌症1、控制不好的糖尿病病人;2、过去5年内明确有恶性疾病的患者或血中肿瘤标记物（AFP,CEA,PSA,CA19-9,CA125）水平明显升高者;3、严重心、肝、肾、肺功能衰竭或一般状况很差不能耐受干细胞移植手术者；4、有心肌梗死或脑梗塞病史者，而有冠心病、脑缺血病史者也要慎用，5、目前仍在吸烟又不准备戒烟者；6、主髂等大

26、动脉闭塞者。自体外周血干细胞移植实施方案骨髓动员57天采集外周血干细胞干细胞移植骨髓动员惠尔血、特尔津或洁欣等，300ug, IH, Qd x 57d监测Wbc30000/ul时，加用速避凝：0.6ml, iH, Qd及肠溶阿司匹林100mg左右。不良反应: 轻微，均自行缓解乏力:2例;胸闷:2例;眼睑水肿:1例，提取外周血干细胞CS3000+血细胞分离机可获得MNC: 24x1010可获得CD34+细胞：1x108细胞量大，可液氮冻存备用（用白蛋白保护）临床观察有效性的主要指标临床症状疼痛冷感跛行时间距离客观指标 皮肤温度（用数字点温仪）踝肱指数血管造影经皮肤氧分压测定溃疡的变化 改良的骨髓干细胞移植治疗下肢缺血性疾病概念：骨髓动员后的骨髓干细胞移植材料和方法2005年5月-12月，下肢缺血35例，43条患肢： 男23例，女12例；年龄平均岁； 糖尿病下肢缺血30例患者（38条患肢）； 单纯动脉硬化闭塞症2例（2条患肢）； 血栓闭塞性脉管炎3例患者（3条下肢）； I期（间歇跛行期）5例（5条患肢）； II期（静息痛期）有15例（19条患肢）； III期（组织缺损期）： I