基因工程小论文

1、绿色荧光蛋白的应用09化学制药 0932220026 唐骏2008年的诺贝化学奖由日本科学家下村修(Osamu Shimomura)、美国科学家马丁 沙尔菲 (Martin Chalfie)和美籍华裔科学家钱永健(Roger Y. Tsien)因在发现和研究绿色荧 光蛋白方面做出贡献而共同获得。绿色荧光蛋白(green f luo rescen t p ro tein,GFP)是一类存在于包括水母、水螅 和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。近 年来，随着GFP在各种异源细胞，如细菌、昆虫及植物细胞中的表达，GFP作为一种新型的 报告物在生物学界引起了

2、广泛的关注，关于它的基本结构、生色团、发光机理及基因的改造 均有大量的研究报道。它是一种操作方便，不用加外源底物，就能在活细胞中检测的分子探 针。将彻底改观过去标记方面的研究方法，在分子生物学研究中有广阔的应用前景。关键词：绿色荧光蛋白转基因技术绿色荧光蛋白的发现与发展1962年，下村修和约翰森等在细胞和比较生理学杂志上报道，他们分离纯化了维 多利亚多管水母中的发光蛋白一水母素。据说下村修用水母提取发光蛋白时，有天下班前， 他将产物倒进水池里。临出门前关灯，回望了一眼水池，见到水池闪闪发光。因为水池也 排放有养鱼缸的水，他怀疑是鱼缸成分影响了光蛋白。然而不久之后，他便确定钙离子能 增强光蛋白发

3、光。绿色荧光蛋白被发现20多年后，才有人将其应用在生物样品标记上。1993年，马丁 沙 尔菲成功地通过基因重组的方法使得除水母以外的其他生物(如大肠杆菌等)也能产生绿色 荧光蛋白，这不仅证实了绿色荧光蛋白与活体生物的相容性，还建立了利用绿色荧光蛋白研 究基因表达的基该方法，而许多现代重大疾病都与基因表达的异常有关。至此，生物医学研 究的一场“绿色革命”揭开了序幕。后来，美籍华人钱永健系统地研究了绿色荧光蛋白的 工作原理，并对它进行了大刀阔斧的化学改造，不但大大增强了它的发光效率，还发展出了 红色、蓝色、黄色荧光蛋白，使得荧光蛋白真正成为了一个琳琅满目的工具箱，供生物学 家们选用。目前生物实验室

4、普遍使用的荧光蛋白，大部分是钱永健改造的变种。1 GFP在转基因研究中的应用特点目前转基因研究与应用的发展十分迅速，将GFP基因应用到转基因研究中，具有其它基因所 无法比拟的以下诸多优点。1. 1 GFP荧光稳定，易于检测GFP的荧光较稳定，抗光漂白能力比荧光素强，能耐受较长时间的光照。GFP在pH712 范围内都能正常发光；对高温(70%)、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂和大多数普通酶等都有 较强抗性”】。GFP中的发色团是由其一级结构中的一段三肽自然形成，该发色团的形成只需 要氧气，不依赖于酶或者其它辅助因子，仅以紫外光或蓝光激发，即可发出绿色荧光。用肉 眼、荧光显微镜均可以观察到。且灵敏度高

5、，还可进行表达量的半定量或定量检测。另外，GFP中氨基酸的替换可产生不同光谱特性的突变体，且增强了荧光强度，适合在 不同物种中专性表达。Tsien卜川发展了颜色迥异的GFP突变体，包括蓝色荧光蛋白BFP(blue fluorescent protein)、青色荧光蛋白 CFP(eyan fluorescent protein)和黄色荧光蛋白 YFP(yellow fluorescent protein)。随着研究深人，抗酸、抗漂白、亮度高(消光系数与量 子产率乘积)、成熟快及单体结构的GFP变体将越来越多，激发和发射光谱范围也将不断拓宽， 对该蛋白的检测将越来越容易。1. 2表达调控简单，构建

6、栽体方便GFP中的发光团由一些常见的非特异氨基酸构建而成，它的翻译后修饰过程不需要原有 水母(A. victoria)细胞中任何其它成分或共因子，在细胞内呈自主表达。利用GFP发光时， 只需要操纵细胞合成GFP蛋白，元需复杂的翻译后加工过程，GFP就会自动折叠催化并开始发 光，在微生物、植物、动物中都获得了成功的表达。由于GFP分子量较小，只含有238个氨基 酸，编码GFP的基因序列也较短，约为2. 6 kb l，所以它可以很方便地同其它序列一起构 建多种载体，而不至于使质粒过大而影响转化效率。2 GFP在转基因研究中的应用进展2. 1用于筛选转基因成功个体外源目的基因转入宿主后，能稳定整合的

7、频率低，通常是将携带有目的基因的载体转到 若干个宿主中，再从该若干个细胞(或其它)中筛选出成功转化并表达目的基因的个体。因此， 如何准确和有效地区分转化与非转化细胞、筛选转化成功的个体是转基因研究中重要的一 步。在这一步中，科研工作者通常是在目的基因上游加一个筛选标记基因，利用筛选标记基 因在移植前进行阳性筛选，仅把阳性细胞移入受体，则可大大提高转基因动植物的成功率， 减少转基因个体筛选鉴定的工作量。目前常采用的筛选标记基因主要有：氯霉素乙酰转移酶 基因(CAT)，葡萄糖苷酶基因(GUS)，荧光素酶基因(Lue)，新霉素磷酸转移酶基因(NPT)，潮 霉素磷酸转移酶基因(HPT)等。利用这些标记

8、基因时，有些需要复杂的样品固定和制备过程、昂 贵的底物；有些需要漫长的抗性筛选，对胚胎有一定的毒害作用；大部分还需要特殊的检测 手段，给转基因研究工作增加了难度，均不够理想。而将GFP应用于标记基因，可以避免以 上缺陷，能够有效、快捷的对转基因个体进行筛选，大大提高了转基因工作效率。黄国存等 引分别用花粉管通道法和农杆菌介导法将携带有GFP基因的外源基因导入棉花，发现用手持 紫外灯结合显微镜检技术能够快速地对转化子进行活体筛选鉴定，明显比GUS检测方法优越。 程在全等.引用基因枪法将带有绿色荧光蛋白基因的质粒 pJPM5和pSBG700分别转入水稻 TNG67愈伤组织，在荧光显微镜下观察到了绿

9、色荧光蛋白基因的表达，绿色荧光蛋白基因表 达出的绿色荧光蛋白信号比植株的自发荧光强得多，且不会受自发荧光的太大影响。因此， 绿色荧光蛋白基因可以作为水稻(甚至小麦、玉米)转基因研究中的报告基因。李华等.刮将 GFP表达质粒导人BHK、DK、RK等真核细胞，建立真核细胞转基因指示系统，结果表明，GFP 的表达对胚胎无损伤，又经济简便，可避免B一半乳糖苷酶等报告基因的不足，是提高基因 转移与筛选效率的理想途径。Vain等第一次对抗生素筛选与GFP筛选进行了直接比较，研究 表明GFP能大大提高转化的工作效率，减少了转基因植株分子检测步骤和工作量。2. 2用于寻找转基因所需的启动子、增强子等调控元件基

10、因的表达调控研究与转基因研究相辅相成，用转基因方法可研究基因的表达调控，而 基因的表达调控研究可更好地指导并应用于转基因研究。启动子、增强子等是基因表达调控 的重要元件，也是转基因所需的组件。用不同的启动子与GFP基因相连，构成不同的表达质 粒，用于转化合适的细胞，通过观察细胞的荧光强度，就可以比较判断启动子的强弱，找出 适合用于转基因的启动子。Clontech公司构建了 一种叫启动子报告载体(Promoter reportervector)，即没有启动子的GFP质粒，专门用来测试各种启动子对GFP表达的效率， 以及某些增强子对GFP表达的调控效果。用玉米C4PPDK基因5端的非翻译片段(5

11、UTR)与花 椰菜花叶病毒的35S启动子连接，GFP在玉米原生质体中的表达效率比对照质粒(只有35S启动 子)提高近15倍，因为5 UTR片段中含转录增强子.“。将蓝氏贾第虫谷氨酸脱氢酶(GDH) 启动子和GFP构成融合基因，转化贾第虫，可以观到绿色荧光，从启动子的5 一末端进行逐 步缺失，制备一系列突变体并构成融合基因，转化蓝氏贾第虫，能确定出GDH启动子核心序 列。2. 3用于探索不同物种的有效转基因方法转基因的方法很多，适用于不同生物的转基因方法也不同。在做转基因之前，研究者必 须先摸索出最有效的方法，以提高转基因的成功率。目的基因构建到表达载体上后的表达情 况通常是不清楚的（有许多表达

12、条件需要摸索），一旦检测不到基因的表达，就很难判断是转 基因方法不恰当，还是基因表达本身出现问题。所以如果直接用目的基因进行有效转基因方 法的探索，将给转基因工作带来很多困难。GFP的表达无种属特异性、表达调及翻译后修饰 过程简单易控制、通常表达量也很高，将目的基因替换为GFP基因进行不同生物转基因最优 方法的探索，将会缩小研究难度。Rolling等.副将腺相关病毒载体（AAV）与与GFP构建成rAAV. GFP重组质粒，经视网膜下 腔注射到大鼠眼内，在整个试验过程（4个月）中均能观察到GFP的表达信号，说明AAV能够有 效地转染视网膜色素上皮细胞（RPE）。Bennett等.引将携带有GFP

13、的cDNA重组腺相关病毒 （rAAV）经视网膜下腔注射到成年的免疫活性小鼠眼内，用激光扫描眼底镜进行观察，试验结 果表明，rAAV能有效稳定地介导视网膜基因转移而无明显的毒性及免疫反应。杨国顺等心刚 利用GFP基因优化了辣椒的遗传转化体系Hu等嵋川用电激法和PEG法同时转化玉米和拟南芥 菜（Arabidopsis）原生质体，GFP在玉米原生质体中表达，且PEG介导比电激法转化效率高； 而拟南芥菜原生质体中未观察到GFP表达。但Sheen等纠利用基因枪（Microprojectile bombardment）轰击拟南芥菜叶片和根组织，观察到GFP的表达。宋军等口纠以绿色荧光蛋白 基因为目标基因，

14、用脂质体转染猪胎儿成纤维细胞，并以绿色荧光蛋白基因转染后的阳性细 胞作为体细胞核移植的核供体，以体外成熟卵母细胞为核受体构建了绿色荧光蛋白转基因克 隆猪胚胎，结果表明，脂质体转染试剂可以高效转染猪胎儿成纤维细胞，获得的阳性细胞具 有支持猪全程发育的潜能。2. 4提高转基因产物的利用率GFP分子量小，它能与多种蛋白质的N端或C端融合，其表达产物既保持了外源蛋白的生物活 性，又表现出与天然GFP相似的荧光特性。许多表达的转基因产物，特别是一些特殊蛋白， 难以分离纯化，而将GFP与目的基因进行融合表达，则使分离纯化变得容易许多。还有研究 表明，改变蛋白质的末端结构，与GFP融合，可以增加重组蛋白质的

15、稳定性IIIJo Kaba等s纠 构建了编码ECF（东海岸热，牛的一种致死性原虫病）子抱子表面抗原P67的重组杆状病毒载 体，结果只有低水平的表达，而P67基因与GFP的c端融合则出现较高水平的表达，重组融合 蛋白能够被P67单克隆抗体识别，非融合蛋白蛋白既具有原有的正常功能，又具有绿色荧光 特性。岳莉莉等旧钊成功地实现了 GFP与HBV（乙型肝炎病毒）抗原基因融合后在大肠杆菌中高 效表达，得到既能发射荧光又具有抗原性的双功能融合蛋白，为获得一种新型发光免疫诊断 试剂奠定了基础。结束语绿色荧光蛋的发光机理比荧光素/荧光素酶要简单得多。一种荧光素酶只能与相对应的 一种荧光素合作来发光，而绿色荧光蛋白并不需要与其他物质合作，只需要用蓝光照射，就 能自己发光。在