-HCY-染色体畸变-小鼠骨髓细胞染色体畸变讲义课件

1、小鼠骨髓细胞染色体畸变1毒理学动物实验的背景毒理学实验学科整体动物实验原则：对实验动物的作用可以外推于人；暴露剂量(高剂量阳性模型)； 暴露途径(与人实际相同/相似)。应用：毒性评价试验一般毒性试验：急性毒性，局部毒性，慢性毒性等； 特殊毒性试验：致癌，致畸，致突变等机制研究(转基因动物)毒理学动物实验进展和趋势： 转基因动物模型从体内试验(in vivo) 体外试验(in vitro)从整体动物试验3R替代试验微核试验 染色体畸变试验 精子畸形试验 Ames试验，等22微核试验回顾3讨论微核试验结果：重点（数了PCE/NCE、多少PCE有微核）骨髓采集问题染色问题，比值偏高固定的问题，细胞数

2、量太少针对结果要进行分析思考题要认真对待染色体畸变试验原理观察染色体形态结构和数目改变称为染色体畸变分析，又称 细胞遗传学试验。优点：将观察细胞停留在细胞分裂中期相，用显微镜直接检 查染色体畸变和染色体分离异常。可以观察到裂隙、断裂、 短片、无着丝粒环、染色体环、双或多着丝粒染色体、染色 体粉碎等。缺点是分裂中期相分析耗时并且需要熟练技巧45染色体皱缩 形态明显6小鼠染色体数目、核型7端着丝粒染色体实验目的及意义目的：掌握动物骨髓细胞染色体标本制作方法了解动物体内染毒及染色体畸变常见类型意义：检测受试物导致动物染色体畸变的能力和 畸变类型8实验动物选择与处理1.动物一般选用成年大鼠或小鼠，每组

3、6-10只，最好雌雄各半；死动3应以照注腹射 腔.染毒与取样时间一般染毒一次或多次，多次更合理。末次染毒后24h处 物，收获细胞. 剂量最高剂量为最大耐受剂量或30%-80% LD50 。低毒物质 最大给药量或人使用剂量的50-100倍。设3-5个剂量组，剂量阔度在100-1000或更大。阴性对 溶剂或生理盐水；阳性对照注射30-50mg/kg环磷酰胺，经 注射1或2次。4. 给药途径原则上采用与人体接触化学毒物相同的途径。92 1.共20只昆明雌鼠（20g左右）2. 阳性物：环磷酰胺，40mg/kg受试物：丙烯酰胺1/8, 1/4, 1/2 LD50(180mg/kg)3. 一次染毒14:0

4、0、腹腔注射，24h后处死小鼠4.分组：分5组 每组4只小鼠，2名学生共一只实验流程总图收获细胞：处死，取股骨，4ml PBS 冲 洗 ， 1500r/min10min，弃 上清，轻轻倒置沥干低渗：轻柔打散，加入0.070mol/L KCl 6ml，37低渗30-35min，第 10min，以枪头吹气泡的方式再次混 匀细胞悬液，加2ml固定液， 1000r/min10min，弃上清，余 0.2ml液体固定：4ml固定液轻柔混匀，室温静 置15min，1000r/min离心10min， 再重复一次，留约0.1-0.2ml液体制片染色：混匀细胞，悬滴于冰冻载 玻片，晾干，姬姆萨快速染色试剂盒 染色

5、，清洗晾干阅片：低倍镜 找良好视野， 换油镜观察重要24h前腹腔注射受试物2-4h前腹腔注射秋水仙素24.5h称重、分组KCl需要 提前预热10体重、分组和注射体积表1112腹腔注射要点？1314尽量向脊柱处剪断15本试验：PBS也可用：滤纸移液器吸取5mlPBS置于离 心管中注射器反复吸取PBS冲洗第二只股骨用同一PBS16自-20冰箱60%乙醇溶液中，取出玻 片25-40cm高度滴片，玻片倾斜30每个标本制备2-3张片滴片 做好标记 自然晾干（可以借助吹风机） 染色（同微核试验） 阅片：一只小鼠找到200分裂相， 观察记录畸变种类，计算畸变率17染色取吉姆萨染液A液，滴加载玻片1 滴，立即

6、取B液，顺序滴加16滴，吸 耳球吹匀AB液，静置10min自来 水背面冲洗载玻片，晾干阅片观察细胞未破裂的中期分结构异常和数低倍镜下选择分散良好， 裂相，油目异常细镜下观察并记录染色体胞。低倍 镜高倍 镜油镜18192021染色体数目计数试剂环磷酰胺：40mg/kg （2mg/ml） 秋水仙素：4mg/kg (0.2mg/ml)缓冲液：PBS（pH7.4）低渗液： 0.07mol/L KCl固定液：甲醇3份冰醋酸1份（30ml甲醇+10ml冰醋酸） 染色剂： 姬姆萨快速染色试剂盒2222；动物天平3台；光学显微镜，20台水浴锅一台；15ml离心机2台； 100-1000ml移液器， 配枪头一盒

7、器具23乳胶手套1副/人酒精棉球及干棉球若干搪瓷盘1个/人直头眼科剪1把/人眼科镊1把/人滤纸若干10ml离心管1支/人，PBS用50ml离心管1支/组，固定液新鲜配制离心管架15ml离心管100ml量筒1支/组，配固定液1ml注射器1人/支载玻片（冰片）45张，60%酒精浸泡，-20备用胶头滴管2支/组玻璃染色缸及片架2个，浸泡冰片用晾片架一组学生共用一个，全班5个玻璃铅笔1支/组25ml滴瓶2瓶/组，AB液洗耳球3个/组，共12个120mm培养皿2个/组，共8个60ml滴瓶2瓶，香柏油、拭镜液镜头纸1本，全班实验报告1. 实验目的意义；2. 实验动物情况、受试物名称、浓度；3. 实验动物体

8、重、随机分组、注射体积和时间；4. 实验操作步骤；5. 记录染色体畸变的种类和计算每张片子、每组平均畸变率；6.讨论实验中关键步骤和细节对结果的影响。思考题：1. 比较染色体畸变和微核试验两者目的意义和方法上的异同2425实验流程总图收获细胞：处死，取股骨，5ml PBS 冲 洗 ， 1500r/min5min，弃 上清，轻轻倒置沥干低渗：轻柔打散，加入0.070mol/L KCl 6ml，37低渗30-35min，第 10min，以枪头吹气泡的方式再次混 匀细胞悬液，加2ml固定液， 1500r/min5min，弃上清，余 0.2ml液体固定：4ml固定液轻柔混匀，室温 5min，1500r

9、/min离心5min，再重 复一次，留约0.2ml液体制片染色：混匀细胞，悬滴于冰冻载 玻片，晾干，姬姆萨快速染色试剂盒 染色，清洗晾干阅片：低倍镜 找良好视野， 换油镜观察重要24h前腹腔注射受试物2-4h前腹腔注射秋水仙素24.5h称重、分组KCl需要 提前预热26移液器吸取5mlPBS置于 离心管中注射器反复吸取PBS冲洗第二只股骨用同一PBS27自-20冰箱60%乙醇溶液中，取出玻片 15-25cm高度滴片，玻片倾斜30 每个标本制备2-3张片 做好标记 自然晾干（可以借助吹风机） 染色（同微核试验）滴片阅片：一只小鼠找到200分裂相， 观察记录畸变种类，计算畸变率28染色取吉姆萨染液A液，滴加载玻片1 滴，立即取B液，顺序滴加16滴，吸 耳球吹匀AB液，