提高里氏木霉生产纤维素酶产量的研究进展(共8页)

1、提高(t go)里氏木霉生产纤维素酶产量的研究进展摘 要：纤维素酶是纤维素类物质的主要水解用酶，由于目前纤维素酶的产量较低，活性较差，导致其无法在多种工业上大量使用。里氏木霉作为优良的纤维素酶生产菌株，使用化学方法或生物方法对其进行改良(giling)，以期提高纤维素酶产量和酶活性。关键词：里氏木霉；纤维素酶；产量(chnling)；活性纤维素类物质是自然界分布最广、含量最丰富的碳源物质，其作为潜在且普遍的可持续能源受到了广泛的瞩目，但是在实际的生产过程中只有少量的纤维素类物质能直接生产出具有高附加值的产物，很难生产这些产物的主要原因是纤维素具有比较强的氢键作用以及结晶结构，范德华力与疏水作用

2、也在其中起到了协同的作用，从而导致了大部分纤维素在水解转化成为它们的单体或者可发酵性糖的过程中出现生产效率低的现象1。在纤维素水解过程中一般使用酸性化学试剂和酶试剂与其进行反应，其中酶水解常常使用纤维素酶。纤维素酶是能降解纤维素的复合酶类，主要产生于细菌、真菌、放线菌、植物、原生动物及部分无脊椎动物等生物体中，由于微生物之外的生物不能大规模培养而不具有实际的应用意义，此外，细菌产的纤维素酶活力较低，且只有少部分能分泌到胞外，而真菌刚好与细菌相反，产生酶的组分也较为适当，具有较好的协同作用，因此真菌是目前研究最广泛的纤维素酶产生菌。丝状真菌中木霉属被认为是生产纤维素酶最优秀的菌种，其中以里氏木霉

3、更为突出2-4。1 前言里氏木霉为丝状的多细胞真核微生物，其工业用菌株常用于生产可以分解不同纤维素类物质的酶类，并且适用于蛋白的生产，拥有良好的合成蛋白和分泌蛋白的能力。里氏木霉生产的纤维素酶为多水解酶所组成的复杂酶系，其中主要包括纤维二糖水解酶（cellobiohydrolase，CBH）、内切-葡聚糖酶(endo-1,4-D-glucanase，EG）以及-葡萄糖苷酶（-1,4-D-glucosidase，EC）。其中纤维二糖水解酶分为纤维二糖水解酶（CBH）和纤维二糖水解酶（CBH），它们均可以作用于纤维素多糖链的末端，水解-1,4-糖苷键，产生纤维二糖；内切-葡聚糖酶水解-1,4-糖苷

4、键，主要作用于纤维素内部结构中的无定型区域，产生的小分子纤维素带有非还原性末端；而-葡萄糖苷酶则可以将纤维二糖水解成为两分子的葡萄糖5-7。基于纤维素酶具有的多种优秀(yuxi)的性能，例如在纤维素酶对纤维素水解的过程中，相较于使用化学试剂对纤维素的水解，其对反应条的要求较低，不需要高温高压，并且具有原料糖转化效率高，转化速度快，在水解过程中无污染产生等优点，故其应用价值也随之受到了更多地重视。目前，纤维素酶的使用已在纺织行业中得到了大规模的推广，纤维织物经纤维素酶处理后，其外观和手感都得到较大改善，还可通过纤维素酶对织物的表面纤维进行剥蚀，使织物表面受到磨损，染料被剥离出来，产生水洗样的仿旧

5、外观；或者利用纤维素酶对织物进行抛光处理，在纤维素酶对纤维素水解的基础(jch)上，再配合机械搅拌的冲击作用可以去除织物表面的小绒毛。食品酿造行业利用纤维素酶对酒类、酱油、食醋的酿造均可提高产物的产量，在酒类酿造方面还可以使酒香更加醇厚，酒类色泽更加纯净，提高色素(s s)提取量等。此外，纤维素酶在洗涤剂行业、饲料行业、造纸等行业都有较好的利用前景2,8,9。但是纤维素酶的应用虽然受到了人们的关注，却很难进行广泛的利用，这是因为不同菌株生产的纤维素酶组分的含量差异较大，且通常纤维素酶的产量不高，活性低，故难以大规模的生产使用。如何提高纤维素酶的产量与活性是纤维素酶研究中重要的课题，目前所选育出

6、来的产纤维素酶菌种虽然具有一定的产酶能力，但真正高效产酶的菌种不多，且性能也不稳定，本文将通过化学方法和生物方法讨论如何提高里氏木霉产纤维素酶的产量，以期获得数量较多、性能良好、活性较高的纤维素酶。2 采用化学方法提高纤维素酶产量在对里氏木霉产纤维素酶的研究中，通过改变里氏木霉的生产条件或添加化学试剂来对其控制是较为常见的手段。酸碱性在里氏木霉的纤维素酶合成的过程中起着一个非常重要的作用10，Li等11,12便对此进行了探讨，通过调节里氏木霉生产中的pH值，改进纤维素酶的发酵工艺，主要对三种纤维素酶组分（内切-葡聚糖酶，外切葡聚糖酶，-葡萄糖苷酶）的生产效率和生产速率的影响，以及对菌丝体的形态

7、的影响进行了研究。首先得知，在不同pH的条件下，三种纤维素酶组分的产量是各有差异的，根据蛋白质的生产数量和生产速率与滤纸酶活对纤维素酶系的酶活力水平的测定共同推断出里氏木霉对纤维素酶生产的最佳pH值约为4.5-5.0左右。以此为基础，联系实际的工业生产，改善传统的分批发酵方式，而采用控制pH的补料分批发酵方式对纤维素酶进行生产，具有节约原料，提高产酶效率等多种优点。此外，采用补料分批发酵方法，根据具体生产所需的酶，选择使用适合的具有先进的控制功能的生物反应器改变里氏木霉的培养条件，能选择性提高纤维素酶的生产4,13。此外(cwi)Callow等14则在选择(xunz)适合pH值得基础上，采用添

8、加表面活性剂的方法(fngf)，促使里氏木霉Rut C30的表面颗粒生长，此形态能使纤维素酶易于分离，从而提高纤维素酶的生产。相同培养条件下，在培养基中添加不同种类的表面活性剂，经过形态分析筛选，Triton X-100与鼠李糖脂的促生长能力最佳。再通过滤纸酶活测定表面活性剂的最佳添加浓度，同时要对表面活性剂所造成的生长滞后性、倍增时间等影响因素进行全面的检测，以期在获得最大纤维素酶活的条件下，将负面影响也减小到最低程度。3 采用生物方法提高纤维素酶产量目前，通过生物学手段从分子层面提高纤维素酶产量是纤维素酶研究的重点。通过随机诱变产生的里氏木霉突变体中，有部分突变体表现出了令人影响深刻的性能

9、增强，在此条件下通过系统生物学工具，如基因组合转录组测序，可以揭示纤维素酶的生产机制，并对突变获得的较高生产性能和较低生产性能的生产菌株进行比较分析15。通过实验分析表明在里氏木霉生产的纤维素酶系中纤维二糖水解酶的含量最高，在纤维素的降解过程中占主导地位。这是因为CBH基因的启动子是强启动子，可用于其他基因的超量表达研究，而CBH对整个纤维素酶系的表达起着重要的调控作用，CBH酶的特异性强，酶活明显高于CBH，降解微晶纤维素的能力比CBH高2倍，但其浓度却远低于CBH。因此研究克隆CBH基因，提高其表达活性，可以增强纤维素酶整体活力16,17。Fang等16,18通过重组里氏木霉ZU-02，提

10、高活性纤维素酶生产，增强纤维二糖水解酶的生产。实验中，Fang等采用CBH基因的启动子构建重组质粒pCAMBIA1300-潮霉素-PSCT，其含有较强的基因表达框，通过优化的农杆菌介导构建和转化里氏木霉，转化的里氏木霉通过两步筛选，产生324阳性里氏木霉。经检验，重组里氏木霉最高的滤纸酶活比未经重组的里氏木霉高4.3倍，而其生产的纤维二糖水解酶的活性也比原有活性高5.6倍。并且发现经重组后的里氏木霉结合补料分批发酵方式进行大规模的纤维素酶生产，可以有效的改善里氏木霉纤维素酶的生产率，得到的纤维素酶类的活性较高，当20FPIU/g的纤维素酶，10IU/g纤维二糖水解酶和300U/g的木聚糖酶在碱

11、性条件下对农业废弃物玉米秸秆进行预处理，其酶解效率高达93.8%。然而(rn r)使用CBH启动子还可以(ky)提高里氏木霉中外源蛋白的表达量，Meng等17使用(shyng)pWEIIF00表达载体构建一个蛋白质表达系统，此载体是以潮霉素B磷酸转移酶(hph)基因为遗传标记的启动子探针型载体，同时在载体中导入红色荧光蛋白基因（DsRed2）以便对其表达进行检测，是用此系统重组突变体Cel5A。在荧光电子显微镜和自然光下观察转化后的里氏木霉基因重组菌丝体和分生孢子的形态变化，同时采用CMC酶活对转化体所产生的蛋白酶进行测定，相较于野生型菌株，转化体的酶活性提高了31.09%。除了单独采取生物学

12、手段在分子层面对菌株基因进行改良，Zhang等19结合调控pH值的方法，敲除里氏木霉基因中表达相对大的胞外碱性蛋白酶的基因SPW，SPW在牛血清白蛋白作为唯一氮源时，它的转录水平将大约增加到平时的136倍。敲除SPW基因后，胞外蛋白酶活性降低，可以观察到异源的碱性内切葡聚糖酶产量的增加及稳定性的增强。此外，通过农杆菌接到转化，创建T-DNA标签的突变体，进行插入诱变，通过进行滤纸酶活、蛋白浓度以及相关酶活性得知纤维素酶的产量得到提高20，或通过RNAi介导基因沉默，有效抑制CBH基因的表达，CBH的减少可导致里氏木霉生产异源酶的产量增加，使能获得所需的酶含量增加21。4 展望(zhnwng)纤

13、维素是自然界中最丰富的资源之一，进行以纤维素为发酵底物的纤维素酶的生产是目前及将来的研究重点(zhngdin)，提高纤维素酶产量及其活性，使纤维素酶可以在多种行业中展现其本应具有的应用能力，目前(mqin)多采用分子生物学手段提高里氏木霉生产纤维素酶的产量与活性，因为其所得效果优于其它方法，且一般不对环境产生污染。若采用多种方法结合，弥补彼此不足之处，减少彼此所带来的负面影响。改善提高纤维素酶产量的方法，以期在生产过程中减少生产成本，生产时间，且得到较多的性能优良的纤维素酶。参考文献1Feng Jiang, Qingjun Zhu, Ding Ma, et al. Direct convers

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