[工程科技]色谱分离技术课件(PPT 60页)

1、色谱分离技术与应用韩金玉天津大学化工学院化学工艺系学科进展讲座1第1页，共60页。1903年，俄国植物学家Tswett首先提出了“色谱法”的概念20世纪50年代后期，分析型高效液相色谱技术开始兴起由于经典方法难以实现更高的分离要求，制备规模的色谱逐渐发展起来为了适应科技和生产的需要，生产规模的色谱相继出现一、概述（一）发展简史2第2页，共60页。（二）色谱分离过程的特点应用范围广分离效率高操作模式多样高灵敏度在线检测3第3页，共60页。二、基本原理色谱分离过程的实质是溶质在不互溶的固定相和流动相之间进行的一种连续多次的交换过程它借助在两相间分配的行为差别而使不同的溶质分离不同组分在色谱过程中分

2、离情况首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异（一）、分离原理4第4页，共60页。（二）固定相色谱过程常用柱填料的种类如下：硅胶衍生固定相离子交换树脂大孔吸附树脂凝胶手性固定相纤维素衍生物环糊精相聚（甲基）丙烯酰胺n-酸和n-碱固定相5第5页，共60页。（三）、色谱柱及柱技术柱装填方法高压匀浆法干法径向压缩法轴向压缩法环向压缩法色谱柱设计 轴向流动柱径向流动柱6第6页，共60页。根据分离样品量的不同分生产规模色谱半制备色谱三、分类大规模色谱7第7页，共60页。扩展床吸附色谱制备型加压液相色谱制备型超临界流体色谱根据制备与生产中应用的设备分模拟移动床色谱8第8页，共60页

3、。离子交换色谱疏水作用色谱 正相/反相色谱亲和色谱 分子排阻或凝胶过滤色谱根据溶济和固定相之间的相互作用机理分9第9页，共60页。四、色谱分离过程基本理论（一）保留值、分离度和柱效率 保留值 保留值是色谱过程的基本热力学参数 之一，也是 色谱定性的基础数据。通常以保留时间及容量因 子来表示。 从进样开始到柱子另一端流出的样品的浓度达到 最大值时所需要的时间为保留时间 ，它与固定相 和流动相的性质、柱温、流速和柱体积等有关。10第10页，共60页。 分离度 定义为相邻色谱峰顶之间的距离除以二色谱峰的 平均宽度 ，表示为：其中：tR1、 tR2 分别为两组分的保留时间 wb1、wb1 分别为两峰的

4、基线宽度 RS 表示两组分的分离度11第11页，共60页。 柱效应衡量色谱柱效率一般使用塔板高度和、塔板数，实际工作中以下时计算塔板数（N）：理论塔板高度表示为：其中：w1/2 是峰高一半处的峰宽 L 是柱子的长度12第12页，共60页。（二）、色谱理论模型平衡色谱理论 于1940年由wilson提出，假设在整个色谱过程中，色谱 柱中不存在船只阻力，溶质在固定相和流动相中的分 配平衡能瞬时完成。 能很好的解释谱线的移动速度，以及非线性等温线时流 出曲线的形状。 但由于忽略了非理想流动及各种传质阻力的存在，这个 模型是比较粗略的。 塔板理论 将色谱过程比拟为蒸流过程，色谱柱可看成是有一系列 理论

5、塔板所组成的。 理论板可以对色谱流出曲线分布、谱带移动规律，以及 柱长等对区域扩张的影响给予近似的说明。 是半经验理论13第13页，共60页。 轴向扩散理论是Amudson等在大量实验的基础上提出的理论认为：在色谱过程中，组分在流动相中的轴向扩散影响色谱区域谱带扩张的主要因素，而有限的传质速率对区域谱带扩张没有影响。基本方程为：该理论考虑了溶质在流动相和固定相中的传质速率即流动相的流动状态，具有较好的指导意义。14第14页，共60页。（三）、非线性色谱理论注入函数质量平衡方程传质动力学平衡等温线 通常用多组分的Langmuir方程描述矩形输入和矩形阶梯输入输入组分量=输出组分量+积累量色谱过程

6、很复杂，获得的动力学方程也非常复杂，难以得到方程的解。15第15页，共60页。（四）、普遍化速率模型 模型假设 色谱柱为等温体系 柱内任意截面上流动相线速度相同，径向浓 度梯度可忽略 扩散和传质系数在操作过程中保持不变，且 不受混合效应的影响 多孔颗粒为球形，大小均一，填装均匀，孔 内固定相浓度和液相浓度处于平衡状态 多孔颗粒孔内流动相处于静止状态，没有对 流流动，溶质传递仅靠扩散进行 溶质由流动相主体向固定相颗粒传递的过程 遵循也摸传质机制16第16页，共60页。模型的建立 流动相主体的无因次方程：初始和边界条件此处 固定相颗粒的无因次方程： 略17第17页，共60页。参数估计 吸附等温线方

7、程 Horvath等认为反相键合色谱的分离机理属于但 分子层吸附可用Langmuir方程来表示轴向扩散系数：液膜传质系数：固定相孔隙率和床层孔隙率 对于硅胶固定相近似认为：固定相孔内扩散系数 估算式为：18第18页，共60页。 模型方程数值解 对流动相主体采用有限元法，对固定 相颗粒采用正交配置法 通过上述两种处理，获得一个由常微 分方程组成的方程组 美国Ohio州立大学的顾庭岳博士编制 了Fortran77计算程序19第19页，共60页。五、典型制备色谱工艺及应用（一）、模拟移动床色谱（ SMB ) 原理SMB色谱是连续操作的色谱系统，它由多根色谱柱（大多为5-12根）相连而成，原理示意如右

8、图：20第20页，共60页。根据结构特点可分为三带和四带SMB色谱：三带SMB色谱四带SMB色谱21第21页，共60页。 建立SMB色谱分离工艺的步骤设置工艺要求确定溶解度选择固定相优化分离条件工艺参数模拟中试研究被分离的物质在流动相中的溶解度要足够高，才能实现经济有效的分离以保留时间、被分离物质在流动相中的溶解度和选择性为条件HELP等各种模拟软件的使用22第22页，共60页。 90年代，开始用于药物尤其是手性药物的离，目前已发展到吨级工艺，如： UDP公司每年可以生产用于制备抗抑郁的药物氟西丁单一异构体的中间体(R)-3-氯-1-苯丙醇1000kg 1999年Novasep公司在美国加州的

9、Aerojet公司建立了柱内径达800mm的SMB体系 2000年Novasep公司又推出了由6个内径1000mm柱组成的SMB体系 SMB色谱的应用23第23页，共60页。SMB分离一种药物中间体喹啉甲羟戊酸乙酯外销旋混合物（称DOLE)的实例SMB中试工业装置图图为Novasep公司生产的Licosep12-100装置。它由12根内径为100mm高为150mm的不锈钢柱、五个膜式泵、多个双向阀和UV检测器组成。床层内填料的高度可在50-150mm范围内调节,温度控制在10-50之间，系统的耐压能力为不超过100bar。24第24页，共60页。SMB分离过程流程图25第25页，共60页。实际

10、操作的工艺条件和运行结果 由上表可以看出在实际的工艺条件下，产品纯度达到了99.4%，生产能力为每天0.268kg（异构体）/kg(固定相），溶剂消耗量为440L/kg异构体。在设备允许范围，高流速、短切换时间有利于提高生产能力。26第26页，共60页。近年来SMB色谱技术已经成功地用于多种手性药物的分离提纯，这项技术对于制药工艺发展的重要性已被公认。应用实例如下表：27第27页，共60页。从细胞培养液的上清液中分离纯化单克隆抗体，产率达90%以上 利用离子交换树脂为固定相，从微生物培养体中回收氨基酸，赖氨酸纯度达98.5%以上以PVP树脂为固定相，在10根柱子组成的SMB系统中分离两种氨基酸

11、，分别由残液中得到纯度96.7%的L-苯基丙氨酸，由萃取液中得到纯度达99.7%的L-色氨酸 SMB色谱技术在生物分离领域也有较广泛的应用，如： 大多数SMB色谱分离采用的手性固定相为纤维素衍生物和淀粉纤维素衍生物。上表中有18个例子是采用这类手性固定相 28第28页，共60页。（1）SMB色谱是一个连续色谱分离过程，这个特点使得 制备色谱分离过程实现自动化操作和稳定的产品质 量控制 （2）SMB色谱技术比其它制备色谱的分离效率高 （3）SMB色谱技术可以实现旋光异构物分离过程从分析 型色谱条件快速、可靠地放大 （4）SMB色谱装置可以适合不同规模的色谱分离过程因此，SMB色谱有可能成为化学工

12、业及精细化工的一个新的操作单元，随着系统设计方法及固定相的不断开发研究，SMB色谱技术的应用将日益广泛 SMB色谱技术的优势29第29页，共60页。（二）、扩展床吸附色谱 （EBA） EBA色谱是适应基因工程、单克隆细胞工程等生物工程的下游纯化工作需要而发展起来的一项色谱技术 EBA色谱的基本原理和特点 EBA色谱的工作原理与一般的吸附色谱相同，但工作过程不同，其示意图如下： 30第30页，共60页。如上图所示， EBA工作过程为：凝胶颗粒在向上的流体作用下向上扩展当向上的液体流速与凝胶颗粒的沉降速度达到平衡时，凝胶颗粒处于平衡悬浮状态，这时形成稳态流动柱床，柱塞的位置处于柱床的顶部接着将经离

13、心、澄清过滤等处理的样品液以上向注入柱床，目标蛋白质吸附在凝胶颗粒上，而有形颗粒直接穿 过柱床柱床随着液相上向流动而得到冲洗，未被吸附的物质都 流出床层，这时停止上向流动液体，凝胶颗粒沉降下来，柱塞也逐渐下降至沉降床层表面然后以洗脱液下向流动进行洗脱，得到目标蛋白质的浓缩液，以便进行进一步纯化工作洗脱完成后，用适当的缓冲液对柱床进行再生。31第31页，共60页。EBA色谱具有如下特点： EBA色谱过程中，有形生物体可通过床层。因此可将生物工程下游纯化技术中的离心、澄清过滤等多步骤提取过程简化为简单的一步色谱分离过程，大大简化了工艺，缩短了提取时间，节约了生物工程中下游纯化的资金投入 EBA色谱

14、是兼具批量吸附技术和填装吸附色谱（Packed Bed Adsorption，PBA）优点的实用技术，具有对原材料依赖性低，吸附效率高的特点。因此，EBA色谱可在短时间内对目标生物分子起到浓缩作用，且分离过程中凝胶无损失，可重复使用，易于控制，易于规模化等。 32第32页，共60页。 EBA色谱常用固定相（凝胶）及选择原则Streamline系列凝胶（Amersham Pharmacia Biotech公司设计生产 ）Cetamic Hypet D系列凝胶（法国Biosepra公司生产 ）Fractosil系列 （德国Merck公司生产，以多孔硅胶为基质 ）Bioran系列 （德国Schott

15、 Glaswerke公司生产，以多孔玻璃为基质 ）DM-I凝胶 （以纤维素-钛混合为基质 ）Macrosorb K4AX凝胶 （以硅藻土-琼脂糖混合物为基质的）常用EBA凝胶 33第33页，共60页。EBA色谱的凝胶选择原则 凝胶介质的颗粒大小和密度能使原材料的生物体和吸附剂颗粒间的临界沉积流速产生明显的区别 凝胶介质的颗粒大小和密度分布应使EBA扩展过程尽量小的固液轴向混合 吸附剂应能耐受培养基中生物体、核酸、脂类物质等的污染 连接到吸附剂上的配基应足够稳定 吸附剂的物质转移能力在EBA色谱应用中足够有效 34第34页，共60页。 EBA色谱柱床的特征 床层扩展的影响因素 床层扩展平衡后所达

16、到的高度受到吸附剂颗粒大小和密度，流动相线性速度及流动相粘度的影响，如流速的影响： 右图所示为使用Streamline凝胶和未修饰的琼脂糖吸附剂时，在不同流动相流速下床层的相对扩展程度 35第35页，共60页。床层扩展的绝对高度随着操作温度和缓冲液体系（液体密度和粘度）的改变而改变 如下图所示，床层扩展后的高度随着缓冲液体系的不同而改变，同时随着缓冲液流速增加而增高。因此，在EBA色谱应用于粘度很大的原料液时，密度和粘度对床层的影响是一个重要因素36第36页，共60页。EBA与填充吸附色谱柱床（PBA）的吸附特征非常相似下图所示为以Streamline DEAE为吸附剂，在扩展床和填充床两种情

17、况下，柱床对BSA的穿透容量 扩展床的吸附特性 由图中可见，在两种情况下，穿透容量及穿透曲线的斜率仅有微小差别。这就表明了在PBA和EBA模式中，吸附剂的吸附性能是极其相同的。37第37页，共60页。扩展床操作压力通常填充床的床层空隙率为0.3-0.4，而扩展床的床层空隙率则很高，约为0.7-0.8所以在整个操作过程中，扩展床的操作压力都相当低，通常低于0.5bar（50kPa） 38第38页，共60页。物理参数 影响EBA色谱的参数 化学参数影响EBA色谱的主要因素可大致分为两方面： 与操作条件有关的，如：操作温度、液体流速及沉降床层高度等 与液体培养基的组成相关的，如细胞密度、生物体含量和

18、液体粘度等 是指影响分离过程选择性、负载容量的因素。主要包括pH值、离子强度、凝胶的特性、缓冲溶液种类等 39第39页，共60页。 EBA色谱的应用 从S.cerevisiue匀浆液中提取葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH） EBA色谱系统：色谱柱为Streamline 50，内径50mm，装 填吸附剂Streamline DEAE（与Procion Red H-ETB偶 合）420ml，相应的沉降床层高度为21cm原料液：粘度为5.0mPa，生物体干重为6.8%（w/w）。上样量：以G6PDH的总活性单位计，活性单位U/柱动 态容量=23%上样前先进行床层扩展，以152cm/h的流速由底部向

19、床层通入pH6.0，50mM的硫酸钠溶液，床层扩展达稳定后，床层高度为42.5cm。上样过程中保持扩展床层高度。然后以含25%（V/V）甘油的硫酸钠溶液（pH=6.0，50mM）将残渣及未吸附组分洗出床层，大约需1BV硫酸钠溶液即可清洗完全。然后以硫酸钠溶液（pH=6.0，50mM）以152cm/h流速将床层中的甘油洗出。40第40页，共60页。 洗脱过程中需从柱顶部向床层通入洗脱液，此例中以梯度洗 脱方式洗脱吸附的G6PDH,洗脱液流速保持在152cm / h ，洗脱液梯度组成为： 50mM盐酸三乙胺溶液，pH8.0 含NaCl（100mM）的50mM盐酸三乙胺溶液，pH8.0 含NADP（

20、10mM）的50mM盐酸三乙胺溶液，pH8.0 含NaCl（2M）的50mM盐酸三乙胺溶液，pH8.0在上述操作条件下，G6PDH的产率为99%，平均纯化倍数为103。以浊度计及显微镜对得到的G6PDH进行分析，未发现其它物质。整个纯化过程约需3h，其中平衡时间40min，上样时间30min，清洗时间60min，洗脱时间50min。研究还表明，该EBA色谱系统循环使用10次以上，分离效果不变 41第41页，共60页。大规模质粒DNA的提取 Hanak等人采用EBA色谱提取质粒DNA（p DNA），规模达到kg级的E.coli细胞湿重。 具体作法为：首先将E.coli菌体破碎，进行DNA和pDN

21、A的初步分离，然后将含pDNA的混悬液直接进行EBA色谱提取，制备出了符合基因治疗用药标准的pDNA 。而采用其它方法则提取难度大，成本高，不易规模化，不能满足pDNA的用量需求Clemmitt等人采用一步吸附EBA色谱从E.coli细胞悬浮液的匀浆液中直接提取-半乳糖苷酶回收率为87%，纯化倍数为5.92，比活性为154U/mg，相当于采用其它多步骤方法制备的商业性-半乳糖苷酶的相应指标42第42页，共60页。(三）、制备型超临界流体色谱（Pre-SFC ） 原理及特点 是用二氧化碳等一类的气体，使其处于临界状态下成为临界流体，以这种临界流体作流动相的色谱法。它是处于液体色谱和气体色谱之间的

22、色谱方法。CO2是在SFC中最常用的最安全的超临界流体 原理43第43页，共60页。优势 在Pre-SFC中，通过改变流动相温度或压力即可改变其密度，色谱分享的特性就会随之改变，这样一种单一的流动相就可以用于多种用途的分离，而无需为柱平衡耗费时间，这在以溶剂为流动相的色谱方法中是难以做到的 收集的馏分中的流动相容易去除，通过简单的降压就足以将SF-CO2气化 流动相回收简便。收集气相CO2，通过一定设备净化后可使其重返超临界状态，循环使用，由于CO2易于回收、成本低廉，使Pre-SFC对工业极具吸引力，尤其是在生产成本中流动相占最大比例的情况下 44第44页，共60页。局限 技术相当昂贵。例如

23、色谱柱的设计：色谱柱应能承受相当高的压力变化（如300bar4,500 psi ），而且在色谱柱承受增加的压力时要防止对填料的损坏。目前特殊的动态轴向压缩柱也满足此要求，但也不能完全解决费用昂贵的问题。 超临界CO2的溶解性能不可能溶解所有物质，通常需加入改良剂改善溶解性能，但同时部分抵消了其一些优势 45第45页，共60页。 操作的特殊点 上样量主要受样品在超临界流体中溶解度的影响，而不是色谱柱的负载量 一种方法是使用前置柱上样 另一种方法是对以上方法的改进 上样流分的收集收集被分离物质的方法有以下几种： 解除超临界流体的压力 在高压容器中收集，然后缓慢降压 冷却收集容器，使CO2固化 吸附

24、于一种固体上，然后用溶剂进行洗脱 溶解在一种收集溶剂中 46第46页，共60页。 超临界模拟移动床色谱（SF-SMB） 在SMB色谱系统 ，当以超临界流体为流动相，通过调节操作压力就可以进行梯度操作，因为调节压力就改变了超临界流体的溶解性能，因而相当于改变了流体组成，这就是SF-SMB 色谱 Novasep公司的许多研究表明，SF-CO2-SMB应用于植物萃取物的纯化取得了极好的结果，而且已在几个制药企业实现工业化应用 47第47页，共60页。 Pre-SFC的应用 Pettinello等利用一根装填硅胶的色谱柱（520X100m，I.D.） 进行中试规模Pre-SFC分离，其装置流程图如下：

25、分离纯化EPA-EE应用该装置，从68%EPA-EE的鱼油中得到纯度为93%的EPA-EE，收率高于40% 48第48页，共60页。分离极性化合物 赵锁奇等采用全多孔空白硅胶为固定相，二氧化碳加极性携带剂及酸碱性改良剂为三元流动相，在自建的一套克级Pre-SFC装置上，成功地对黄酮类物质和生物碱混合物进行了分离 对黄酮类化合物的制备分离，每次循环时间15min。操作压力为25MPa，温度45，流动相中携带剂加入量为10%（其中携带剂中含H3PO40.5%），流速为20ml/min可得纯度达96%黄酮，总回收率80% 49第49页，共60页。（四)、制备型加压液相色谱（prePLC） 一般为间歇

26、式操作：间歇上样，即样品进入色谱系统后，必须完全流出色谱柱后才能进行下一次的分离纯化过程。样品溶液由柱顶端加入色谱柱中，用泵连续输入流动相，样品溶液中溶质在流动相和固定相之间进行扩散传质，由于溶质各组分在两相间分配情况不同，造成各组分在柱中移动速度不同而得到分离。柱出口流出液经检测器检测，通过色谱工作站将流出液的浓度变化以色谱峰的形式描述，形成制备色谱峰图形，根据依次流出色谱柱的色谱峰对流出液中各组分进行收集 基本操作原理 50第50页，共60页。 上样根据样品地溶解度不同液体上样固体上样一般应尽可能选用流动相溶解样品为提高生产能力，需增加上样量，可采用增加样品体积和提高样品溶液浓度两种方式

27、是解决样品低溶解度的一种方法，将样品的干粉与柱填料混合或预先吸附在填料上，然后加至柱顶或将混合物加入分离柱前的前置柱中 51第51页，共60页。 流出液切割收集技术色谱柱在超载状态下工作，样品的 提纯量增加得比较大，需采用切割收集技术，以增加单位时间的物料通过量。切割收集技术两种方式: 中心切割技术: 主要用于从混合物中分离一种主要成分， 当色谱柱超载时，主要色谱峰前后两端受 到微量组分的污染，需采用中心切割技术 得到纯组分 边缘切割技术: 主要用于色谱系统的选择性不足以将 两个或多个相距很近的主要成分进行分 离中,通过切割所需成分相应色谱峰的前 部和后部获得纯品52第52页，共60页。 产品回收和溶剂循环产品回收和溶剂循环操作流程 如图：色谱分离系统预浓缩净化溶剂 固液分离溶剂循环浓缩干燥53第53页，共60页。 动态轴向压缩色谱（ DAC ） DAC色谱中使用动态轴向压缩色谱柱，柱效很高。其采用球体高效细颗粒（1020m甚至更小）固定相装填柱子，由于粒径的减小，直径增大，柱内的管壁效应减弱，甚至可以得到高于分析柱的柱效DAC色谱从根本上解决了制备色谱技术的放大问题。DAC技术使得柱效不依赖于柱内径大小，这样就可以实现由分析柱到制备柱的直接放大，而且色谱柱床层的长短可通过改变固定相的使用量进行调节 主要特点 5