生物化学·DNA的复制和修复课件

1、第十四章 DNA的复制和修复 本章重点介绍遗传中心法则和DNA的半保留复制以及逆转录的过程和机理，对DNA的损伤和修复、突变和重组作一般介绍。思考 DNA是绝大多数生物体遗传信息的载体，继1953年Watson & Crick提出DNA双螺旋结构模型后，1958年，Crick提出了“中心法则”(Central dogma)揭示了遗传信息的传递规律。遗传信息传递的中心法则蛋白质翻译转录逆转录复制复制DNARNA生物的遗传信息以密码的形式储存在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序。在细胞分裂的过程中，通过DNA复制把亲代细胞所含的遗传信息忠实地传递给两个子代细胞。在子代细胞的生长发育过程中，这

2、些遗传信息通过转录传递给RNA，再由RNA通过翻译转变成相应的蛋白质多肽链上的氨基酸排列顺序，由蛋白质执行各种各样的生物学功能，使后代表现出与亲代相似的遗传特征。后来人们又发现，在宿主细胞中一些RNA病毒能以自己的RNA为模板复制出新的病毒RNA；还有一些RNA病毒能以其RNA为模板合成DNA，称为逆转录,这是中心法则的补充 中心法则总结了生物体内遗传信息的流动规律，揭示遗传的分子基础，不仅使人们对细胞的生长、发育、遗传、变异等生命现象有了更深刻的认识，而且以这方面的理论和技术为基础发展了基因工程，给人类的生产和生活带来了深刻的革命。概念复制(replication)： 以亲代DNA分子为模板

3、合成出子代DNA分子的过程。转录(transcription)： 以DNA分子为模板合成出与其相对应的RNA的过程。翻译(translation)： 在RNA的控制下，根据核酸链上的三联体密码合成出具有特定氨基酸序列的蛋白质多肽链的过程。反转录(reverse transcription)： 以RNA为模板将遗传信息传给DNA的过程。目 录第一节 DNA的复制（DNA指导下的DNA合成）第二节 DNA的损伤与修复第三节 DNA突变 第一节 DNA的半保留复制一、概念和实验依据二、DNA复制的起始点和方式三、 DNA聚合反应有关的酶类四、DNA的半不连续复制五、原核细胞DNA复制过程六、DNA复

4、制的忠实性七、真核细胞DNA的复制八、真核和原核DNA细胞复制比较 DNA半保留复制 （semi-conservative replication） 半保留复制假说的提出： 1953年，Watson & Crick在DNA双螺旋基础上提出。DNA半保留复制概念 DNA在复制时，两条链解开分别作为模板，在DNA聚合酶的催化下按碱基互补的原则合成两条与模板链互补的新链，以组成新的DNA分子。这样新形成的两个DNA分子与亲代DNA分子的碱基顺序完全一样。由于子代DNA分子中一条链来自亲代，另一条链是新合成的，这种复制方式称为半保留复制。DNA的半保留复制实验依据 1958年Meselson & st

5、ahl用同位素示踪标记和密度梯度离心技术实验,证明了DNA是采取半保留的方式进行复制: 将E.Coli培养在以15NH4Cl为唯一氮源的培养基中生长；提取其DNA；进行氯化铯密度梯度离心。再移至14N培养基中生长、提取DNA、离心分析。复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图(Caims实验)P407先看课本 用3H-胸苷标记大肠杆菌DNA，经过近两代的时间，3H-胸苷掺入大肠杆菌DNA。用溶菌酶把细胞壁消化掉，使完整的大肠杆菌染色体DNA释放出来，放射自显影，得到上图。非复制部分（C）银粒子密度较低，由一股放射性链和一股非放射性链构成。已复制部分站整个染色体的三分之二，其中一条双链（B）仅有一股链

6、是标记的，另外一股双链（A）的两股链都是标记的，银粒子密度为前二者的两倍。ABC环状DNA的复制ABC二、DNA复制的起点和方式 基因组能独立进行复制的单位称为复制子(replicion)，每个复制子都含有控制复制起始的起点(origin)和终止复制的终点(terminus)，复制一旦开始，即继续下去，直到复制结束。 1、复制起点：原核生物：1个起点; 单复制子；可连续发动复制 真核生物：多起点；多复制子 2、方向：多为双向(实验) 3、复制叉：细菌为环状DNA,复制起始于单个位点， 双向，半保留，每个复制泡（眼）包括2 个复制叉。 4、DNA复制方式 5、完成一次复制的时间DNA的双向和单向

7、复制环状 DNA复制时所形成的结构起始点复制叉的推进复制叉起始点起始点起始点复制叉复制叉未复制DNA单向复制双向复制实验先用低放射性的3H标记的dT培养E.coli，经数分钟后转移到 含高放射性3H标记的dT培养基中，继续培养，得到含3H的DNA；放射自显影。推测：若放射性中间低，两端高双向； 若放射性一端高，一端低单向；实验证明：生物染色体DNA是双向复制，并且是对称的。例外：枯草杆菌、质粒R6K、质粒Col E。（线粒体DNA的复制方式）（某些噬菌体DNA复制方式）完成一次复制的时间：细菌DNA复制叉移动速度：50 000bp/min真核生物10003000bp/min例：某细菌的染色体是

8、环状的双链DNA分子，有5.2106个碱基对三、原核生物DNA聚合反应有关的酶类（一）DNA聚合酶(DNA polymetases)（二）引物酶(peimase)：启动RNA引物链的合成。 (三） DNA连接酶（DNA ligase）p419（四）DNA的两条链解开后才能作为模板，解开其双螺旋的结构是一些酶和蛋白共同作用的结果，目前已知的解旋、解链酶共3种，包括拓扑异构酶(topoisomerase)、DNA解链酶(DNA helicase)、DNA单链结合蛋白(single-strand binding protein, SSB)。解旋酶DNA聚合酶III解链酶RNA引物引物酶和引发体DNA

9、聚合酶ISSB335355RNA引物DNA聚合反应和聚合酶1、DNA聚合酶反应特点：以四种dNTP为底物需要模板指导需要有引物3-羟基存在 DNA链的生长方向是53产物DNA的性质与模板相同2、大肠杆菌的DNA聚合酶3、3种DNA聚合酶的比较需要4种脱氧核糖核苷三磷酸需要模板作为指导合成方向大肠杆菌的DNA聚合酶 (DNApolymerase, DNApol)催化形成新的磷酸二酯键；有外切酶活性。含有5种不同的DNA聚合酶1、E.coli DNA聚合酶需要原料：4种dNTP；DNA模板；与模板互补的一段RNA引物；Mg2+；Zn2+ （酶活性部位）；DNA聚合酶功能 DNA聚合酶I主要起损伤修

10、复作用。每秒可聚合10个左右的碱基。催化dNTP加到DNA链的3-OH末端（方向53） 5 3外切酶活性，可切除引物；3 5外切酶活性，可纠错；DNA聚合酶5-3外切酶活力5- 3核酸外切酶水解位点单链缺口5DNA聚合酶的3- 5外切酶水解位点3355错配碱基3- 5核酸外切酶水解位点2、 DNA聚合酶活力比聚合酶高；反应需Mg2+、NH4+；以带缺口的ds DNA为模板，反应同酶；具35外切酶活性；但无53外切酶活力;是一种修复酶而非复制酶。3、DNA聚合酶 由多个亚基组成的蛋白质，是大肠杆菌细胞内真正负责DNA链延伸的复制酶；具3 5外切酶活性；活性高大肠杆菌DNA聚合酶全酶的结构和功能1

11、0种亚基DNA聚合酶 两个亚基夹住DNADNA聚合酶异二聚体核心酶帮助亚基校对促使核心酶二聚化聚合活性组建核心酶引物的结合和识别，形成夹子大肠杆菌三种DNA聚合酶比较DNA聚合酶分子量每个细胞的分子统计数5-3 聚合酶作用3-5 核酸外切酶作用5-3 核酸外切酶作用聚合能力DNA聚合酶109,000400+（纠错）+（切引物）弱120,000100+-一般400,00010-20+-强比较项目DNA聚合酶切除引物损伤修复修复酶非复制酶复制功能 1999年发现聚合酶和，它们涉及DNA的错误倾向修复（errooune repair） *DNApol主要负责DNA链延伸。DNA连接酶(ligase)

12、：作用：催化相邻的二个DNA片段间5磷酸基团和3羟基生成磷酸二酯键而连接。条件：两片段相邻；两片段需与同一互补链结合;反应耗能。拓扑异构酶（topoisomerase）兼具内切酶和连接酶活力，能迅速将DNA超螺旋或双螺旋紧张状态变成松驰状态，便于解链。，增加DNA连环数，消除负超螺旋DNA解链酶(DNA helicase)：又称Dna B断裂DNA的互补碱基间的氢键，使双链分离使复制叉前方DNA双螺旋解开一小段，复制 过程中该酶随复制叉的伸展而前移。每解1个bp需耗2个ATP。大肠杆菌在解链时还需要另外两种酶： Dna A辨认起始点 Dna C协助Dna B结合在起始点并打开双链DNA单链结合

13、蛋白(Single Strand Bindingprotein, SSB) ：几分子的SSB与已分开的DNA单链紧密结合，以防两链重新结合成双螺旋。还可以防止单链模板被核酸酶水解。四、双链DNA复制的分子机制（DNA的半不连续复制）1、冈崎片段和半不连续复制 2、RNA引物3、半不连续复制过程 冈崎片断和半不连续复制冈崎等提出DNA的不连续复制模型，认为：35走向的DNA是由许多53方向合成的DNA片段连接而成的。实验放射自显影、电子显微镜观察 冈崎片段： 以53走向DNA为模板合成的小片段。 约1000-2000bp。 结论：DNA是半不连续合成的。前导链（leading strand):以

14、35 链为模板，新生链以53方向连续合成；后随链(lagging strand): 由冈崎片段连接成的DNA链为后随链。RNA引物 通过对新合成的DNA链分析发现它们以共价键连接着一小段RNA链；经RNA酶水解证明RNA链位于DNA片断的5端。以上说明：冈崎片断的合成需要RNA引物。RNA引物酶（RNA primase)：为多聚体； 功能：催化引物合成，在DNA模板链的一定部位合成并与其互补，合成方向53。引物酶合成的引物为十几个核苷酸。冈崎片段引物的合成不需要特异的起始部位。半不连续复制过程：A、引物酶按DNA模板合成出前导链和后随 链引物。B、DNApol在引物上延伸（前导链和后 随链）。

15、C、完成DNA合成后，DNApol用其53 外切酶活性除去引物并填补缺口。D、DNA连接酶将两个冈崎片段连接起来。引发体（解链酶、引物合成酶、RNA引物）五、原核细胞DNA复制过程(1)解旋：由拓扑异构酶解除超螺旋；(2)解链：由DNA解链酶催化，SSB与单链DNA结合，防止双链间氢键再形成； (3)RNA引物合成：以DNA为模板，在引物酶催化下由DNA转录生成5-10个 核苷酸链；(4)DNA链延长：在引物3-OH基上，按碱基互补原则经DNA聚合酶（主要是 酶）催化DNA链从53延伸。前导链为连续的；后滞链 为不连续的冈崎片段。(5)切除引物，补齐缺口：由DNA聚合酶催化，切去RNA引物；

16、按碱基互补原则，沿53方向，补齐缺口。(6)连接封口： 由DNA连接酶催化，将补齐缺口的3-OH基与下一个冈崎片段 的5-P以磷酸二酯键连接起来（消耗NADH+）最终形成完整的、 与模板互补的DNA新链(7)校正并修复DNA：由DNA聚合酶校正并切除错配，再按53方向加上 正确核苷酸。大肠杆菌复制体结构示意图DNA复制的忠实性 DNA复制过程是一个高度精确的过程，据估计，大肠杆菌DNA复制5109碱基对仅出现一个误差。保证复制忠实性的原因主要有以下三点: DNA聚合酶的高度专一性（严格遵循碱基配对原则） DNA聚合酶的校对功能（错配碱基被3-5外切酶切除） 起始时以RNA作为引物DNA聚合酶的

17、校对功能聚合酶错配硷基复制方向正 确核苷酸555333切除错配核苷酸起始时以RNA作为引物的作用 DNA复制为什么要合成一个RNA引物，而后又把这个引物消除呢？这是保证DNA聚合过程高度精确的又一措施。 已知DNA 聚合酶具有35外切酶功能校对复制过程中的核苷酸，也就是说聚合酶在开始形成一个新的磷酸二酯键前，总是检查前一个碱基是否正确，这就决定了它不能从头开始合成。因此先合成一条低忠实性的多核苷酸来开始DNA的合成，并以核糖核苷酸来表示是“暂时”的，当DNA开始聚合以后再以53外切酶的功能切除，以高忠实性的脱氧核苷酸取而代之，确保复制的忠实性。七、真核细胞DNA的复制真核细胞DNA复制与原核类

18、似，但更复杂，不同之处：1、真核生物的DNA通常与组蛋白构成核小体，以染色质的形 式存在于细胞核中。2、DNA模板上有多个起点，即真核细胞DNA复制由多个复制子共同完成。3、真核生物染色体在全部复制完成之前起点不再重新开始 复制，而快速生长的原核生物起点可以连续发动复制。 4、有5种DNA聚合酶：、；5、端粒（telomere)的复制真核细胞DNA复制的特点 多个起点复制起点起点起点起点起点起点真核生物的DNA聚合酶DNA聚合酶 分子量亚基数细胞内分布功能外切酶活力DNA聚合酶 110-23,000四个细胞核引物合成无120,000二个线粒体线粒体DNA合成3-5外切酶400,000二个细胞核

19、核DNA 合成 3-5外切酶DNA聚合酶 DNA聚合酶 45,000一个细胞核修复DNA无端粒（telomere)的复制端粒：线形染色体末端富含G的核苷酸序列。端粒酶（telomerase)功能：稳定染色体末端结构，防止染色体间末端连接，并可补偿滞后链5末端在切除RNA引物后造成的空缺。端粒、端粒酶意义：与细胞衰老、凋亡有关； 正常：体细胞端粒酶活性丧失。 异常：肿瘤细胞端粒酶活性恢复，端粒复制，细胞恶性增殖。 抑制端粒酶活性可防治肿瘤。端粒酶（telomerase） DNA复制需要引物，但在线形DNA分子末端不可能通过正常的机制在引物被降解后合成相应的片段.如果没有特殊的机制合成末端序列，染

20、色体就会在细胞传代中变得越来越短。这一难题是通过端粒酶的发现才得到了澄清。端粒酶是催化端粒复制的一种核糖核蛋白，携带RNA模板（与端粒互补）的逆转录酶。可使复制以后的线形DNA分子的末端保持不变。功能：1）起模板作用；2）有逆转录酶的作用。 初步研究表明，人体中生殖细胞的端粒长度保持不变，而体细胞的端粒长度则随个体的老化而逐步缩短。对此的一个推论是：人的生殖细胞具端粒酶的活力，体细胞则否。这一问题的解决无疑会有助于对生命衰老的认识。53AAAACCCCAAAACCCCCCA端粒酶端粒复制:1）借RNA与末端ssDNA互补；2）以酶上RNA为模板合成一段DNA；3）延长的ssDNA反折为双链。是

21、不依赖模板DNA的复制来补偿切除引物引起的末端缩短。真核和原核DNA细胞复制比较第二节 DNA的损伤与修复 某些物理化学因子，如紫外线、电离辐射和化学诱变剂等，都有引起生物突变和致死的作用，其机理是作用于DNA，造成DNA结构和功能的破坏，称为DNA的损伤。DNA的修复主要有以下类型: 二、 直接修复（光裂合酶） 五、诱导修复（SOS修复）三、切除修复四、重组修复 一、错配修复（核酸外切酶切除，聚合酶修复）DNA紫外线损伤的光裂合酶修复1、形成嘧啶二聚体 影响DNA双螺旋结构2、光复合酶结合于损伤部位3、酶被可见光激活4、修复后酶被释放DNA的损伤和切除修复碱基丢失碱基缺陷或错配结构缺陷切开核酸内切酶核酸外切酶切除DNA聚合酶DNA连接酶核酸内切酶核酸外切酶切开切除修复连接糖苷酶插入酶碱基取代DNA的重组修复胸腺嘧啶二聚体复制核酸酶及重组蛋白修复复制DNA聚合酶DNA连接酶重组SOS反应的机制未诱导的细胞靶基因lexA基因被LexA 蛋白质部分阻遏recA基因被LexA 蛋白质部分阻遏（40个不同的位点被阻遏）LexA(阻遏物) RecA(辅蛋白酶)靶基因表达lexA靶基因表达 但产物被分解recA大量