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1、交通大学体内IL-2瘤苗抗肿瘤效应及安全性检测The study about ANTI-TUMOR EFFECT AND SAFETYOF IL-2 GENE VACCINE IN VIVO：张某某医学院附属瑞金医院普外科海指导老师：学科（专业）：外科学（普通外科学）培养：交通大学医学院附属瑞金医院攻读学位：学位答辩时间：2008 年 5 月交通大学性本人郑重:所成交的，是本人在导师的指导下，独立进行取得的成果。除文中已经注明的内容外，本不包含任何其他个人或集体已经或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本的法律结果由本人承担。作者签名：日

2、期：年月日交通大学使用书本作者完全了解学校有关保留、使用的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交的复印件和，允许被查阅和借阅。本人交通大学可以将本的全部或部分内容编入有关的数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等保存和汇编本。（），在年后适用本书。本属于不（）。（请在以上括号内打“”作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日目录中要体内IL-2瘤苗抗肿瘤效应及其安全性检测摘 要目的:本课题转导白细胞介素-2（IL-2）的肠癌细胞瘤苗的抗肿瘤效应及其安全性检测。方法：结肠癌细胞株 COLO205 采用脂法稳定转染 IL-2，应用 ELISA 法检测瘤苗的 IL-2 的表达，筛选高表

3、达 IL-2的细胞克隆作为瘤苗。将已构造好的结肠癌鼠模型分为两组，采用瘤体内注射的方法，注射经 60Gy60Co 照射的瘤苗细胞（治疗组）和 PBS缓冲液（对照组）,密切观察肿瘤生长状况，五处死所有鼠，取出肿瘤，观察并称重，免疫组化法检测 IL-2的表达。把已制瘤苗用 60Co 进行照射，将照射瘤苗细胞继续培养，备好的大肠癌用苔盼蓝染色法测定细胞的存活率，将照射的瘤苗细胞和未照射组的瘤苗进行荷瘤试验。结果: 获得瘤苗最高表达为 COLO205-H5 量为 139.13 ng/1107/24h。瘤体内注射瘤苗组的鼠肿瘤生长缓慢，较早达到期，而对照组的肿瘤生长迅速，差异有显著性。（ t=2.7,p

4、0.05）治疗组肿块的重量也明显小于对照组（t=7.2，p0.01）。移植瘤治疗组IL-2 免疫组化结果显示阳性，而对照组为,说明了瘤苗在移植瘤IL-2。照射 60Gy60Co 瘤苗细胞培养在 25 天内全部死体内存活并亡，荷瘤试验显示照射后的瘤苗未能成瘤，而照射组均已成瘤。结论:通过体内实验证实了 IL-2转导结肠癌细胞的瘤苗具有一定的抗肿瘤效应，经 60Gy60Co 照射后能消除其致瘤性，为肿瘤的治疗提供了一定的实验基础。:大肠癌,白细胞介素-2,瘤苗，移植瘤英要The studyabout ANTI-TUMOR EFFECT AND SAFETY OFIL-2 GENE VACCINE

5、IN VIVOABSTRACTObjective: To investigate the anti-tumor effectof IL-2genevaccine and detect its safety.Methods: Eukaryotic expresvectors containing humanIL-2gene was stably transfectedo colorectal cancer celllinecolo205bylipofectamine.TheclonesstablyoverexpresIL-2 gene were identified byELISA detect

6、ion,the clones ofhighly stably overexpresg of IL-2 wereobtained and used for subsequent test. The athymic nude micecarrying the human colon cancer were subdividedo two groups:treatment groups and placebo groups. The cell clones containingIL-2 gene were irradiated by 60Co(60Gy) and used as treatmentg

7、roup, the phosphate-buffered saline (PBS) administration wasused for the placebo group. After 5ks, killing all mice ,unloading the tumor lump and determining its weight, detectingIL-2 gene expresby using immunohistochemical staining.60CoProliferative viability of IL-2 gene vaccine irradiated by(60Gy

8、)was testedbytypan excluassayinvitro,tumenesis capacity of IL-2 gene vaccine irradiated by60Co(60Gy) was tested in xenograft tumor ms in athymic nudemice in vivo.Result: We obtained clones of highly expressing IL-2 genein colon cancer cell line colo205, and the secretion level ofcell clones of highl

9、y expressing IL-2 gene was 139.13ng/1107/24h. The nude micereatment group show the slower tumorgrownd smaller tumor weight compared with those in placebogroup(t=2.7,p0.05 ； t=7.2 ， p0.01).Immunohistochemicalstaining shows IL-2 gene overexpresice of treatmentgroup while little expresof IL-2 gene in p

10、lacebo group.The IL-2 gene cell vaccine irradiated by 60Co(60Gy) shows lowerproliferative viability and detach the culture plate after 25days by using typan exclumethod in vitro, the IL-2 genecell vaccine irradiated by 60Co (60Gy) have little tumenesiscapacity in nude mice in vivo.: We studied anti-

11、tumor effect of colon cancercell line colo205 transferredIL-2 gene in vivo and its safetydetection, our results showthe cell vaccinesess some60Coanti-tumor effect and cancercell vaccine irradiated by(60Gy) loss its tumenesis.KEY WORDS: colorectal cancer,erleukin-2, gene vaccine，xenograft tumor引言大肠癌是

12、一种常见的，近年来呈现逐年升高的趋势。目前，大肠癌的治疗方法主要是以手术为主、辅以局部或全身的放化疗，并有了很高的提高，但50%左右的仍然死于转移和复发1。近30年来，随着人类对大肠癌的发生、发展的分子机理不断深入的，人类对大肠癌在水平上已有深入。大肠癌的发生、发展是一个多步骤，多阶段的复杂过程2，其主要是由的癌的激活和抑癌的失活、DNA修饰功能缺失和机体免疫功能低下等引起的3。大肠癌的治疗已取得一定的临床实验疗效，并将们更加重视，将会为结直肠癌患临床治疗带来新的选择方法,尤其对出现转移的晚期的大肠癌患者带来。大肠癌的发生、发展经历了多、多步骤的过程，其中与环境、饮食、和遗传协同作用有重要的关

13、系4 5。大肠癌在发生发展过程中经历生活一系列的突变和（或）缺失，造成其不仅在生物学特征方面不同于正常的细胞，而且在免疫学方面也发生显著变化6。如一些突变和异常表达，使肿瘤细胞表面出现新的抗原，一些缺失或表达下降，造成某些抗原丢失7，这些改变使得肿瘤与机体免疫系统之间曾出现错综复杂的关系：一方面肿瘤细胞表面存在特异性抗原，机体免疫系统能识别这些抗原并产生一系列免疫应答，最终排斥肿瘤8；另一方面，机体免疫系统受包括肿瘤本身在内的许多影响，发生免疫耐受，使肿瘤逃避宿主免疫，得以生长并发生侵袭转移9。治疗诞生于上世纪 80 年代末及 90 年代初，作为一种新兴的治疗是主要的候选疾病10。但肿瘤属复杂

14、已正式进入临床试验，疾病，可能涉及多种的异常，发病过程是多阶段多步骤的，至今只有部分被鉴定，肿瘤发病的分子机制尚未完全清楚。目前主要存在的有如何选择有效的转导11。靶、如何实现有效的治疗是从水平调控细胞中缺陷的表达，修补有缺陷的，或以正常矫正、替代缺陷的，达到治疗缺陷所致的遗传病免疫缺陷；或的激活和(或)抑癌失活所致的肿瘤等疾病治疗12。目前采用的主要因癌等13。策率有：突变的矫正、前提药物的激活、免疫应答的增强、溶瘤目前针对大肠癌治疗主要有：治疗、原癌和抑癌有治疗14 15，而免疫关的治疗、免疫治疗、联合治疗是当前研究的一个热点。无论性的还是获得性的免疫反应都被认为机体抗肿瘤重要的机制16。

15、大肠癌细胞具有抗原性，能诱导机体产生免疫应答，但绝大多数肿瘤仍能继续生长并发生转移，说明机体的免疫系统未能发挥抗肿瘤作用。免疫学发现，肿瘤抗原尤其是弱抗原在肿瘤长期的刺激下，可作用于不同分化的状态的抗原特异性淋巴细胞，使其处于特异的免疫无应答状态17。无论性的还是获得性的免疫反应都被认为机体抗肿瘤重要的机制18。肿瘤细胞还可以通过不表达抗原表位、抗原调变脱落或加工缺陷、缺乏 MHC-I 类分子或免疫共刺激分子等途径逃避机体免疫系统的。在患者外周血中常出现 T 细胞亚群的紊乱，表现为 CD4细胞（Th）减少，CD8细胞（TcTs）增加，CD4CD8细胞比值下降或倒置，同时 NK、LAK 细胞也存

16、在不同的程度的活性下降。此外，细胞因子谱也常出现紊乱，表现为TGF-、IL-10、VEGF、和 PEG 等细胞因子浓度升高，而 IL-2、INF-、GM-CSF 和 IL-12 等浓度的下降19。人们设想通过免疫调节剂增强肿瘤免疫原性、解除机体免疫耐受，以调整免疫应答达到祛除肿瘤的目的20。肿瘤免疫治疗已有一个多世纪的历史。早期应用灭活的肿瘤细胞、细胞滤过或粗提取物进行主动免疫治疗，但效果不佳。其后应用经物理、化学或生物学方法，如加热、冷冻、放射线治疗、加入神经氨酸酶或等方法，处理肿瘤细胞制成肿瘤。或将作为佐剂的 BCG 或 BCG-多糖类物质与肿瘤联合注射。以上方法应用于肾癌和黑色素瘤治疗取

17、得了一定的疗效。此后人们探索将一些外源性导入肿瘤细胞，以增强其免疫原性，有利于被机体免疫系统识别，激发特异性细胞毒性反应21。据 Wiley公布的治疗临床试验资料显示已成为其主要研究领域，占总方案数的 66.2。当前大肠癌治疗主要涉及免疫治疗、纠正突变的 P53、抑癌的激活和腺介导癌细胞裂解等策略。其中免疫治疗约占三分之二，多数采用的策略是经逆转录将细胞因子导入肿瘤细胞，制成“瘤苗”，注入患者体内后通过局部境，增强宿主的特异性抗肿瘤免疫反应22 23。细胞因子改变肿瘤微环白细胞介素 2 具有广泛的免疫调节作用，其在结直肠癌的生物治疗中的价值已得到肯定24。IL-2 主要有活化的 Th1 或 C

18、D4+T 细胞产生25，通过自和旁方式作用于靶细胞，有效地激发宿主特异性抗肿瘤免疫反应（CTL、CD4+和CD8+ ）和非特异免疫反应（NK、LAK、巨噬细胞等）26。临床应用 IL-2 单用或联合 LAK、TIL 治疗大肠癌取得了一定的疗效，但其疗效成剂量依赖性，而相应的毒副反应却限制了其大剂量应用27，因此难以充分发挥疗效。本采用逆转录作为载体于体外将外源性的 IL-2转到至同种异体的肠癌细胞株，筛检扩增建立高表达的细胞克隆，建立肿瘤细胞。在体外检测外源性 IL-2的整合和表达情况，并冻存于液氮中（本实验小组先前已完成）。复苏瘤苗，采用 ELISA 检测瘤苗的表达 IL-2，选用高表达量的

19、细胞瘤苗，作为后续实验使用。瘤苗安全性处理采用照射 60Co 的方法，剂60Co量为 60Gy。照射过后瘤苗细胞无论在体内还是在体外均失去无限增殖的能力，通过 60Co 照射灭活了其致瘤性，具有安全性。建立大肠癌动物模型，给予瘤体内注射瘤苗细胞，而对照组给予 PBS,两组结果对比，在体内进行检测证明转导 IL-2肠癌瘤苗的有效性。为 IL-2瘤苗治疗大肠癌的有效性、安全性提供了重要的试验依据，丰富了大肠癌的治疗。试验材料细胞株肠癌细胞株 SW1116、COLO205 和 HT-29 由本实验组冻存于交通大学医学院生化，IL-2转导肠癌细胞瘤苗SW1116、COLO205、HT-29，由本实验组

20、先前完成并冻存于交通大学医学院生化。细胞培养RPMI1640 培养液、0.25胰酶、胎牛购于 GBCO杂交试验ELISA 试剂盒购于 Diaclone 公司。动物模型Balb/c小鼠 24 只购于并饲养于中国试验动物中心。免疫组化兔抗人 IL-2的多克隆抗体 和 HRP 标记的羊抗兔抗体购于Sigma 公司。试验方法细胞培养大肠癌细胞系及肿瘤细胞培养于 1640 基础培养液中，含 10%的胎牛血清的，于 37，5%CO2，相对湿度为 90%的培养箱中培养。定期换液和细胞计数。大肠癌瘤苗生物活性的鉴定抗体夹心 ELISA 法检测 IL-2 表达（蛋白质水平检测）各细胞克隆培养上清样品在室温下解冻

21、，适当稀释，按说明书配置各试剂，取待测样品、标准液及对照液各 100l 分别加入 96 孔反应板微孔内，于各孔内加入 50l 生物素标记的抗 IL-2 检测抗体，室温下孵育 1 小时，漂洗 3 次。加入 100l 链球菌素亲和素辣根过氧化物酶溶液，室温下孵育 30 分钟，漂洗 3 次。加入 100l 显色剂 TMD,避光孵育 15 分钟后加入 100lH2SO4 溶液终止反应，立刻上酶标仪检测。根据标准样品的不同稀释的浓度及相应的 OD 值作标准曲线，查看所侧细胞上清样品的 IL-2量，用 Excel 完成。挑选稳定高表达的细胞克隆作为后继的动物试验所用的瘤苗。瘤苗安全性的检测照射 60Co

22、对瘤苗细胞生长的影响胎盘蓝排斥试验测定细胞的存活率将照射后的瘤苗细胞用1 x PBS洗2次，025胰酶消化，然后用1ml完全新鲜培养液悬浮，取4滴于载玻片上，用苔盼蓝染色染色23分钟，细胞中深蓝色颗粒浸润即为细胞，透亮的则为活细胞。4滴样品各随机取视野计算100个细胞，细胞存活率=活细胞数100。把4个数值平均，即为某一天细胞的存活率，总细胞数x存活率即得某天的活细胞数。瘤苗荷瘤试验把瘤苗按是否照射 60Co，分为两组：照射组和未照射组，注射瘤苗细胞悬液于鼠侧背部皮下，进行荷瘤试验，每组六只鼠，密切观察两组鼠生长状况，看是否长出移植瘤（具体的步骤见下面“鼠移植瘤模型的建立”）。实验分两组：照射

23、 60Co 转染 IL-2 的 COLO205 瘤苗细胞组和照射 60Co 转染 IL-2 的COLO205 细胞组,每组 6 只鼠，共 12 只。体内实验检测瘤苗的抗肿瘤效应。结肠癌细胞系 COLO205鼠移植瘤模型的建立1)Balb/c小鼠 12 只，鼠龄 45 周，体重 1525g，购于中国实验动物中心鼠饲养于无菌室层流架无特定病原体(SPF)环境中，给予高压灭菌的水和饲料食用。2)COLO205 大肠癌细胞生长至亚融合状态时，弃完全培养液，PBS 洗涤 3，0.05%typsin/0.02% EDTA 消化成单细胞悬液，800 rpm5 min，4离心；用 PBS 重悬细胞，细胞数调整

24、至 1108/ml。在每只小鼠侧背部皮下注射肿瘤细胞悬液 50l(5106 细胞)。3)4)待移植瘤直径达到 0.5cm 左右时，实验分为两组：治疗组和对照组。应用的转导了IL-2的COLO205 瘤苗对肿瘤组织行瘤内注射，对照组注射 PBS。瘤苗治疗移植瘤把好经检测高表达的转染 IL-2肠癌 COLO205 细胞瘤苗进行复苏，复苏后瘤苗细胞存活率达到 80%以上，待细胞生长至亚融合状态，进行安全型处理后（用 60Gy60Co 照射)为治疗组，对照组为 PBS。当荷瘤鼠移植瘤直径达 0.5cm 左右时,进行治疗试验。治疗组向移植瘤内注射瘤苗（细胞量大约为 1107 个/每只鼠，制成细胞悬液），

25、对照组为 PBS,两组液体体积相等，每隔 1 周注射一次。从首次注射之日起密切观察两组鼠生长状况，每隔 3 天用游标卡尺检测肿瘤长径和短径，计算并比较肿瘤的体积。计算公式为肿瘤体积：V=(长径短径)/23/6。两组间体积比较采用 t 检验，EXCEL 、SPSS11.5 完成。移植瘤的处理观察 5处死小鼠，解剖鼠，取出肿瘤称重，OCT 包埋，冰冻切片机切片，免疫组化检测 IL-2 的表达。两组间重量比较采用t 检验，SPSS11.5 完成。免疫组织化学检测：1)冰冻切片经冷室温固定 30 分钟后，TBS 洗 5 分钟。2)0.6的 H2O237孵育 20 分钟，以去除内源性的过氧化物酶活性。3

26、)TBS 洗 5 分钟，1:20 正常羊37封闭 30 min。4)加入一抗 37孵育 2h。5)TBS 洗 3 遍后加入 HRP 标记的二抗 37孵育 1h，6)TBS 洗 3 遍，DAB 显色，显微镜下控制显色时间，约 5-10 分钟，苏木素衬染细胞核后封片观察。结果ELISA 检测 IL-2 蛋白水平得表达ELISA 检测 IL-2 蛋白水平得表达结果如表 1 表示。其中 IL-2 表达最高的为 COLO205-H5 混合克隆，表达量为 139.13 ng/1107/24h，表达最克隆是为 COLO205-11，表达量为 129.23 ng/1107/24h，平均表达量高的单克隆为 61

27、.51 ng/1107/24h。未转染 IL-2 的三个结肠癌细胞株培养液上清中均未检测到 IL-2 的表达。总体 IL-2 表达单克隆 IL-2 表达混合克隆 IL-2 表达细胞株克隆数 范围平均值克隆数 范围平均值克隆数范围平均值SW11621028.318.321028.318.3/HT-29241.8938.2715.19221.89 38.2715.7929.3210.6310.23COLO205160139.1361.51110129.2359.43524.12139.1364.25：ng/1107/24hr）表 1(schedule 1s转导大肠癌细胞株 IL-2 的表达情况（e

28、 of gene transducted colorectal cancer cell strain express IL-2unity：ng/1107/24h)瘤苗细胞的安全性检测结果照射 60Co 对瘤苗细胞的影响经60Co照射后瘤苗细胞体外培养，发现随天数的增加，细胞存活率下降，活细胞数减少，照射后一周内细胞的存活率约为50，25天内细胞瘤苗全部，结果见表2（同种细胞两株细胞的检测的结果）。上述结果表明照射明显下降，在第15天时候细胞几乎全部，因此，经60Co照射后后的细胞瘤苗细胞已经失去了肿瘤性的无限增殖能力，失去了致瘤性。剂量天数60Gy13681013152025存活率（）1009

29、75328820.30.060100955225510.20表 2 照射 60Co 对瘤苗细胞的影响influence of radiation tumor vaccine with 60Co)(schedule 2体内实验检测瘤苗的安全性未照射 60Co瘤苗组在第 16 天出现了肿瘤，而照射组未能成瘤,见图 1。60Co体内和体外实验均说明了应用处理过瘤苗细胞已失去肿瘤细胞的无限增殖的能了，失去了致瘤性，用来治疗肿瘤是安全可行的。体内实验瘤苗的抗肿瘤效应治疗组给予瘤移植瘤生长速度明显慢于对照组，对照组鼠生长状态较差，肿瘤体积不断增大，在第 31 天时已有 2 只鼠不能耐受而。治疗组鼠生长状况

30、较为良好，在第 22 天时肿瘤生长已经达到期。在第 31 天时处死所有鼠，取瘤称重。从治疗之日起，移植瘤的生长曲线见图 2，两组间体积比见表 3。处死鼠后取肿瘤，两组间移植瘤重量的比较见表 4。时间点（每隔 3 天）1234567891011治疗组（ 鼠的平均体积）785980113412581431156918922051215421672181对照组（ 鼠的平均体积）8211121145717932234279436854005445149215011t=2.7P0.05表 3. 移植瘤体积比(schedule 3volume ratioof transplaniontumor)12345

31、组别治疗组0.330.50.610.530.47对照组1.051.751.351.401.30t=7.2P0.01表 4 移植瘤重量比weight ratio of transplan(schedule 4iontumor)移植瘤的免疫组化肿块经 OCT 包埋制成冰冻切片后进行免疫组织化学检测。结果显示治疗组移植瘤内 IL-2 表达呈强阳性，而对照组移植瘤内 IL-2 为表达为，见图 3。说明瘤苗在移植瘤内存活，并能继续IL-2。大肠癌是一种常见的，近年来呈逐渐升高的趋势，对人类的生命了极大的威胁。据2007 年显示，的大肠癌发病率居于中居第三位。我国内结直肠癌的也呈逐年上升趋势，位于消化道肿

32、瘤的第二位，每年新发数约为 1316 万，人数约为69 万，多发于大中城市。地区 2005 年统计数据显示大肠癌达 40.8人/10 万，其中每年新增病例 3000 余例，大肠癌发病已成为第二位高发肿瘤。近年来随着电子结肠镜、吻合器和新型化疗药物的临床应用，以及全直肠系膜切除术的推广和新型放疗技术的改进，大肠癌综合诊治水平得到了显著的提高28，总体五年生存率达 50左右29。但欲进一步提高疗效，甚至彻底攻克恶性肿瘤这一顽症，尚需借助于免疫治疗新型治疗方式30。IL-2 具有广泛的免疫调节作用而在大肠癌治疗中得以广发应用。West WH31等阐明体外给予 IL-2 时有一定的生理阈值，即 1.8

33、10IU/m2d,低于此值则无抗肿瘤活性，而达此“阈值”后 IL-2 的输注剂量越高，其效果越好，然而单一 IL-2治疗大肠癌疗效并不理想。利用 IL-2 与其他化疗联合应用，应用免疫疗法，在大肠癌中取得了较好的疗效32 33。但无论是全身还是局部给药，作为药物体外给予的 IL-2 只能按照药代动力学规律吸收、分布和代谢、不可能具备生理或旁的作用模式34。由于状态下比渗漏和淋巴细胞渗透导致的严重的毒副反应限制了给药剂量，使用常规治疗方式难以在肿瘤局部达到有效的浓度35。肿瘤从 20 世纪 80 年代末和 90 年代初以后，肿瘤临床和应用开发，并已成为国际上肿瘤免疫治疗的热点，其中修饰的成为目前

34、的热点。其就是应用重组技术将目的导入肿瘤细胞而成的肿瘤细胞36。Wang XY37等，通过能表达热休克蛋白的 cDNA 转导入鼠源性 CT-26大肠癌细胞，来表达增强其免疫原性，并联合使用 GM-CSF，抑制了移植瘤（CT-26细胞）的生长，显示其抗肿瘤效应。Lyons JA38等利用重组体利基森林颗粒为载体编码了鼠源性的生长因子受体-2，治疗 鼠移植瘤（CT-26 细胞），进行密度分析显示免疫接种的抑制肿瘤的反应，从而达到抑制肿瘤的生长。采用以缺陷型逆转录为载体，将IL-2转染至细胞，建立细胞瘤苗。输入机体后，在肿瘤的局部持续一定剂量的IL-2，有利于肿瘤抗原局部达到有效浓度，增加肿瘤免疫原

35、性，动员T、B淋巴细胞、NK细胞和巨噬细胞等效应细胞，并诱导其分化成熟，产生抗肿瘤免疫反应。同时避免了大剂量的IL-2使用，减少了IL-2的毒副反应表明肿瘤细胞转导IL-2可增加生成，有利于免疫效应的细胞侵润39。同时可以转导多药耐药并联合细胞毒性药物联合使用，产生较好的协同效应40。在体外转导IL-2的鼠源性的大肠癌细胞，而制成的肿瘤，治疗移植瘤表明瘤抵御亲本肿瘤细胞的，延缓肿瘤细胞的，延缓了肿瘤的发展和扩散41 42。Sobol RE43等用缺陷性逆转录为载体把IL-2转染到成细胞中，建立了细胞瘤苗。在临床实验中，将瘤苗和已处理过的肿瘤细胞混合种植于皮下。5例中有4例中出现了T细胞增多。但

36、就疗效而言，并未出现临床缓解病例。由于样本数较少，需进一步加以验证。安全性采用60Co照射后，转导细胞尚能持续细胞因子长达23周，但致瘤性44，采用60Gy60Co照射后的瘤苗细胞，继续培养，一周内瘤苗细胞大约存活50%，25天内全部，而瘤苗细胞的在照射后24小时稍增加，而给予皮下注射1107瘤苗细胞量的注射，未出现毒副反应45。为瘤苗的利用提供安全性保障。同时瘤苗经过照射后，增强了生物活性。本在本课题组完成瘤苗建立和体内生物学检测的基础的上，继续完成后继的试验。由于前期试验已完成的相应的瘤苗，已一段时间，所以在体内检测之前，对以复苏瘤苗细胞进行 ELISA 检测，来选择高表达的瘤苗细胞进行后

37、继的动物试验。经检测， 转染 IL-2的混合克隆大肠癌瘤苗细胞COLO205-H5 的表达量最高。建立大肠癌鼠模型（COLO205 细胞），选用经检测的最高表 IL-2 的大肠癌细胞株，进行安全处理后（采用 60Gy60Co 照射），制成细胞悬液向瘤体内注射，对照组用 PBS，经照射后的瘤苗细胞一周内的存活率约为 50%，15 天内几乎全部，所以采用每隔一周进行一次治疗，观察肿瘤生长情况，描绘肿瘤生长曲线。明显得出，治疗组的移植瘤生长比对照组生长缓的抗肿瘤效应。安全性处理采用给予肿瘤照射 60Co，慢，明显显示了肿瘤60Co量为 60Gy，继续进行细胞培养，测定照射对细胞活性的影响，采用苔盼蓝

38、排斥试验测定细胞计数，一周内瘤苗细胞存活约为 50%，约为 25 天全部，得出瘤苗细胞在体外经 60Co 照射后失去无限增殖的能力。瘤苗细胞进行 鼠荷瘤试验，结果照射组未长出肿瘤，而未照射组则长出肿瘤。从这两方面明显得出，给予肿瘤照射 60Co，瘤苗失去了致瘤性，失去在体外无限增值的能力，而没有改变其生物学活性，达到了安全性处理的目的。本试验成功地在体内证实了IL-2转导肠癌细胞肿瘤抗肿瘤的有效性，采用60Co照射后的肿瘤是具有安全性的。为IL-2瘤苗肠癌的临床试验及应用提供了一定方法借鉴，奠定了试验基础。由于这是一种处于探索阶段的治疗方法，还有一些需要继续解决的问题，如给药的剂量、方法、肿瘤

39、本身免疫性逃避改变等。本课题组采用的同种异体的大肠癌细胞株作为前提细胞，避免了大肠癌元代培养的，简化了瘤苗的治疗，有利于临床的,尤其适用于无法通过手术取得肿瘤细胞的晚期大肠癌肿瘤细胞的晚期。但本课题组将于后继的试验中继续探索大肠癌细胞体外原代培养的成功方法，减少污染，提高成功率，以便建立化的大肠癌细胞瘤苗，提高特异性，增加疗效。同时由于大肠癌的形成是多、多步骤的过程，所以考虑联合其他治疗的方法，如联合其他的细胞因子，以及抑癌，来探索更有效的大肠癌的生物治疗。结论在蛋白质水平上检测了 IL-2修饰的瘤苗的高表达性，建立了大肠癌动物模型，在体内检验了肿瘤抗肿瘤的有效性。在细胞和荷瘤试验两方面证明了

40、采用 60Co 照射后的肿瘤是具有安全性的。为肿瘤的临床试验以及临床应用奠定了基础。参考文献综述大肠癌治疗的现状及展望交通大学医学院附属瑞金医院普外科（200025）综述审校摘要：大肠癌常规治疗方法为手术为主，辅以局部或全身的放化疗，但的年的5年生存率不高。治疗是一种新型的治疗肿瘤的方法，治疗大肠癌是一种有效的治疗方法。将会成为一种很受临床欢迎的治疗大肠癌的方法。本文针对大肠癌的治疗进行综述。：大肠癌；治疗一直以来，大肠癌在我国病率中处于很高的，并有增高的趋势。近30年来，随着人类对大肠癌的发生的的分子机理不断深入的，人类对大肠癌在水平上已有深入的。大肠癌的发生、发展是一个多步骤，多阶段的复杂

41、过程，其主要是由癌的激活和抑癌的失活、DNA修饰功能缺失和机体免疫功能低下等引起的。目前，大肠癌的治疗方法主要是以手术为主，辅以局部或全身的的放化疗，但未能明显提高大肠癌的五年生存率。随着分子生物学技术的迅速发展及对大肠癌发病、发展机制的进一步深入，大肠癌的基因治疗已取得一定的疗效，并将们更加重视，将会成为一种大量应用于临床的肿瘤治疗方法。大肠癌治疗策略的现状及进展1.1细胞因子的治疗：细胞因子的治疗法就是将细胞因子的在体外导入受体细胞后，再回输机体或直接将细胞因子导入体内肿瘤的微环境中产生细胞因子，激活抗肿瘤的免疫反应，从而达到抗肿瘤的效果，目前常用的大肠癌细胞因子主要包括白细胞介素112(

42、IL1-12),干扰素、（INF、），肿瘤坏死因子（TNF），粒细胞集落刺激因子（GM-csf）等。Chikkanna等1应用IL-12治疗大肠癌CT26鼠荷瘤模型后，增强T细胞等免疫细胞的抗C等 2肿瘤功能。Kudo-Saito白细胞介素12（IL-2）偶联rF-GM-CSF治疗能显著增强抗肿瘤效应，联合治疗组瘤体体积比单独治疗组（白细胞介素12治疗）显著减小，肿瘤生长缓慢，转移减少，鼠带瘤存活期延长。为白细胞介素12（IL-12）治疗细胞因子治疗大肠癌提供了理论的可行性，给临床利用白细胞介素细胞因子治疗大肠癌提供了实验依据。Zhao等3ZD55-IL-24治疗结肠癌使肿瘤细胞凋亡率显著增加

43、，而正常细胞不受影响。比传统的ONYX-015或Ad-IL-24治疗有更好的疗效，ZD55载体介导的IL-24显示出更强的抗肿瘤效应。J A Lyons等4将VEGFR-2利用利基森林为载体转染入CT26大肠癌细胞，体内实验发现接种转染细胞的鼠肿瘤密度显著降低，肿瘤增长缓慢，其机制可能是转染大肠癌细胞的VEGFR-2竞争抑制了VEGF与内皮细胞的VEGFR结合。由此可见细胞因子治疗大肠癌具有较好的疗效，并且具有一定的靶向作用，毒副作用小等优点，也可以为术后辅助治疗提供更好的方法，显示其优越的临床价值。1.2 癌和抑癌的治疗：癌是细胞固有的，其表达的产物为生理状态下正常细胞增殖分化所必需的，在一

44、定的条件下被激活，呈现在时间和空间上的差异表达，可导致细胞增殖分化过程失衡而引起细胞恶变，针对等5将胰癌的过度活化可用反义寡核苷酸和（或）核酶抑制癌。Durai岛素样生长因子结合蛋白-4（IGFBP-4）导入大肠癌 HT-29 荷瘤模型内，IGFBP-4治疗组较对照组，Bax 表达增加，Bcl-2 表达下降，肿瘤细胞凋亡增加，密度降低，有效的抑制了鼠移植瘤的生长。Ras在大肠癌中约有 50%的突变突变的肿瘤治疗有一定价值。Dvory 等6构建了三率，所以选择性针对 Ras组 Ras 突变型的结肠癌模型，分别是 R1，SW480 和 HCT116。然后将携带Bax,caspase-8 和 PKG

45、 的导入到上述肿瘤细胞内，有效地抑制了肿瘤的形成。选择性的过表达前凋亡对 Ras突变的结肠癌有很好的抑制作用，而正常组织的细胞生长不受影响。因此，这种疗法对 Ras 突变的大肠癌临床治疗有一定的指导意义。Lledo S 等7应用反义核算技术将 anti-k-ras 和antiomerase 寡核苷酸注入结肠癌细胞 SW480 内，有效地抑制了肿瘤细胞的增殖，其抑制效果取决于寡核苷酸的类型，剂量和作用时间，在剂量为 20mM 作用 48 小时后，细胞下降了 99.67%。反义 K-ras 和端粒酶的结合协同增强了肿瘤的抑制效应，为临床治疗提供了一定的实验依据。抑癌又叫隐性癌、抗癌、肿瘤易感。这类

46、在控制细胞生长、增殖及分化过程中起着十分重要的负调节作用，并潜在抑制肿瘤生长。如果功能缺失、突变等异常可导致恶性转化而发生肿瘤。因此可以通过恢复抑癌的功能来抑制肿瘤的发生、发展，一般将具有正常功能的野生型的抑癌（P53、P16、Rb 等）利用各种途径转染至肿瘤细胞内，重建失活得癌的功能，从而达到抑制肿瘤的细胞异常生长的目的。P53 的突变可见于 50%的结肠癌患者。因此改善 P53 的功能对结肠癌的治疗显得尤为重要。Rayburn 等8发现 TLR9（toll-like receptor 9）激动剂可促进结肠癌细胞的凋亡，提高癌细胞对放，化疗的敏感性，这与其改善等9发现P53 的功能相关，TL

47、R9 可作为未来结肠癌临床治疗的候选药物。Aizup53 的负性调节因子 Mdm2 的抑制剂 Nutlin-3 可激活野生型的 p53 的表达，进而诱导了凋亡Bax 和P的表达，促进了G2/M 期阻滞，抑制肿瘤生长。Nutlin-3 为临床无 P53 突变的结肠癌的治疗提供了一定的实验依据。1.3治疗：一些或细菌的产物可将无毒或极低毒性的药物前体转化为毒性产物，导致细胞，这类被称为。其治疗原理将导入某一细胞，表达并生成特定酶类，转化无毒或极低物前体为毒性产物，从而发挥抗肿瘤作用。WolfgangWalther10等在大肠癌细胞的鼠荷瘤模型（CoLo5734 和 SW480）体内注射 CD，在治

48、疗五天后，瘤体内注射组较对照组肿瘤增长显著降低鼠体内 CDmRNA 和蛋白水平显著升高，CD快速注射有效抑制肿瘤生长，增强抗肿瘤效应。Hiraoka 等11携带 CD的 RCR 载体门脉注射大肠癌细胞 CT26 肝转移荷瘤模型中，肿瘤细胞 RCR 表达量升高，肿瘤生长受到抑制。Li 等12CD偶联放疗能够协同增强抗肿瘤疗效，在大肠癌细胞株（HR8348）的荷瘤模型中，CD联合放疗使肿瘤体积减小了 81.6%，对局部复发性结肠癌有一定疗效。由此可见 CD是一种有效的抗肿瘤，为治疗治疗大肠癌提供了理论依据，为临床治疗大肠癌提供了较好的方法。1.4 抗肿瘤生成形成治疗：1971 年Folkman 提出了肿瘤的生长和转移是依赖型的，阻滞生成是遏制肿瘤生长的有效策略这一学说。现已针对肿瘤形成的分子机制所设计了各种抗生成治疗策略，并已成为目前肿瘤治疗的热点领域。肿瘤的生长和转移有赖于点的形成，肿瘤的的形成取决于促生成分子和抗分子二者之间的平衡。促生成因子是肿瘤形成所必需的，其中最重要的内皮生长因子（VEGF），大肠癌患者中的 VEGF 表达水平与肿瘤