分子流行病学和研究实例

1、分子流行病学和研究实例1 第一节 概述 第二节 主要研究内容 第三节 研究实例2分子流行病学产生的背景 疾病防治使流行病学遇到了一些新的挑战 传染病防治发现病原体耐药性和变异(流感疫苗)病原生物的多样性 (H5N1) 慢性非传染病复杂性状疾病的病因学问题: 基因-环境交互作用3分子生物学理论和技术的飞速发展1953 - Discovery of DNA double helix (Crick & Watson)1960s - DNA transcription mechanism1972 - Recombinant DNA technology1985 - PCR (Kary Mullis)1

2、990s - Human Genome Project2000s - Human Haplotype Project 4人类基因组计划1990年启动，2003年发表完整的基因序列图5人类单倍型图谱计划 reference samples: 4 world populationsNigeria30 sets of triosJapan 45 unrelated individuals China45 unrelated individuals U.S.30 sets of trios SNPs: computational candidates where both alleles were s

3、een in multiple chromosomes genotypes: high-accuracy assays from various platforms; fast public data release 6分子流行病学的发展历程 国外：1972年-提出“流感分子流行病学”1993年：美国Schulte出版了世界上第一本分子流行病学专著分子流行病学-原理和实践 (Molecular Epidemiology: Principles and Practice)。1996年国际流行病学学术会议：狭义分子流行病学是测量作为暴露或效应的生物标志信息大分子：DNA、RNA和蛋白质。从广义上包

4、括任何实验的、生化的测量。7Numbers of Papers with Subject Words “Molecular Epidemiology” on Medline82008, more than 2000 on PubMed! 国内：1985年开始, 将分子生物学研究中一些技术应用于流行病中疾病诊断以及追踪传染源的调查研究。1990年后在流行病学教材中正式列入分子流行病学一章。从1992 年第4 期起,中华流行病学杂志连续7 期发表文章，介绍分子流行病学的产生、定义、研究内容、研究手段及其应用。9分子流行病学定义分子流行病学是应用先进的实验技术测量生物学标志，结合流行病学现场研究方法

5、，从分子水平阐明疾病的病因及其相关的致病过程，并提出与评价相应防制措施的科学。 (徐德忠，1998年)分子流行病学是阐明疾病和健康状态相关生物标志（或分子事件）在人群和生物群体中的分布及其影响因素，并研究防制疾病、促进健康的策略与措施的科学。 (段广才，1999年)10 分子流行病学是流行病学的一个分支(分子生物学？群体遗传学？)分子流行病学的主要研究内容是各种生物标志物及相关过程分子流行病学的研究方法是随着分子生物学的进展不断更新的11几个要点： 特点： 与传统流行病学不同 与分子生物学不同 与群体遗传学不同 宏观与微观相结合的人群研究！12传统流行病学暴露疾病 ？ 前瞻性研究回顾性研究分子

6、流行病学传统流行病学与分子流行病学的关系（EDC模型）（Schulte,1993）暴露疾病13 研究内容生物标志探讨 暴露测量 (E, ID, BED) 效应测量 (EBE, ASF, CD, PS) 易感性测量 (DNA, RNA, Protein, Phenotype)14生物标志的概念 生物标志 (biological markers , biomarkers) 是指能代表生物结构和功能的可识别物质(Phenotype,可测量)。 分子生物标志物 (molecular biomarkers)直接反映外来理化因素与细胞靶分子, 特别是生物大分子如核酸和蛋白质的相互作用及其后果, 是生物标志

7、的主要部分。15生物标志生物标志物的种类 暴露标志（exposure marker, ME）与疾病或健康状态有关的暴露因素的生物标志，称为暴露标志。外暴露标志: 暴露因素进入机体之前的标志和剂量，如病毒、细菌、吸烟烟雾等。内暴露标志：暴露因素进入机体之后的标志。16 1. 体内剂量标志（ID）：外源性物质于暴露后在体内可测量到的剂量标志，表示被人体吸收的外源性物质（性质未改变的或其代谢产物）的数量。吸烟 - 血或尿中的烟草代谢产物可的宁浓度多环芳烃 - 尿中的1- 羟基芘水平饮食暴露- 黄曲霉毒素B1(AFB1)和尿中N-亚硝基化合物的浓度工作暴露和环境污染 - 血清或脂肪组织中的杀虫剂DDT

8、、多氯联苯PCBs、二氧杂芑环氧化物含量 17 2. 生物有效剂量标志（BED）：表示已与靶组织细胞内 DNA或蛋白质相互作用的外源性物质或其反应产物的含量。它是反映靶细胞分子内接触剂量的生物标志物, 主要包括蛋白质加合物 (Protein adduct) 、DNA 加合物 (DNA adduct) 。18生物有效剂量标志DNA加合物 苯并（a）芘 白细胞生物学标志环境暴露物质生物材料蛋白质加合物（血红蛋白） 环氧乙烯红细胞19 效应标志（effect marker, MEF）机体暴露后产生功能性或结构性的生物标志，称为效应标志。生物学反应标志（BR）: 反映了由于结合到靶细胞的外源性物质的持

9、续作用，进一步引起细胞与组织的生物学或生化学的变化。这些变化主要发生在细胞特定部位，尤其在基因的某些特定序列；这些变化可引起机体某些不可逆转的生物学效应。疾病标志（MD） 健康状态标志（MH）20生物学反应标志生物学标志环境暴露物质生物材料染色体诱变化学物畸变苯并（a）芘白细胞姊妹染色体单体交换苯并（a）芘白细胞微核（micronuci）苯并（a）芘白细胞癌基因激活苯并（a）芘组织原嘌呤比例升高铅红细胞乙酰胆碱脂酶降低有机磷杀虫剂血浆21亚临床（早期）疾病的生物学标志血清甲胎蛋白肝癌、肠道疾病、胎儿神经管缺失癌胚抗原胃肠道癌、其它胃肠道疾病肿瘤特异性抗原 各种癌症生物学标志疾病血清谷草转氨酶心

10、肌梗塞22 易感性标志（susceptibility markers, MS）个体对疾病发生、发展易感程度的生物标志。 易感性主要与宿主的遗传特征,以及生长发育、营养、免疫、机体活动状态等有关。不同疾病的不同阶段，都有可能具有不同的易感性标志。 易感性影响着其它生物学标志在机体内的水平；不同个体的易感性不同，与之相关的其它生物学标志的水平也可以不同。23突变剂敏感性分析24易感性基因标志物：1.人类基因组多态性(SNPs, CNVs)2.基因组表遗传修饰(甲基化，乙酰化)25What is a SNP?26 SNP是指在人群中出现的频率1%的先天突变。SNP存在于整个人类基因组中，可能每100

11、300bp就存在一个SNP，估计总数在数百万个 人类基因组计划研究结果表明，不同个体的基因99.9%是一样的，但在序列上有极小(0.1%)的遗传差异，其中主要是 SNP。 研究表明，正是这0.1%的差异授予你我他特有的表型；这个小小的差异还与个体对疾病(包括肿瘤)的易感性、对药物的反应性差别有密切关系。27单核苷酸多态(Single nucleotide polymorphism, SNP)SNP1 (locus 1)SNP2 (locus 2)GATC双倍型 基因型 G/T A/C单倍型GATCSNP and Haplotype (单倍型)Modified from Yang . 28Hap

12、lotype Blocks 单倍型区段人类基因组是由呈现高度连锁不平衡(LD)的快状区段排列构成的这些区段是由小的低LD的重组热点区域分隔的一个单倍型区段可以由一些常见的单倍型的组合来代表ChromosomesSNPSHaplotype BlockPatil, Science, 200129分子流行病学的应用1、疾病病因的探讨 遗传因素起重要作用的疾病往往与基因有关，这不言而喻；而很多与环境因素有关的疾病，也常常需从基因方面去研究，因为环境因素可以通过宿主的基因突变或异常表达引起疾病。 慢性非传染性疾病 肝癌 黄曲霉毒素 （体内外检测） 传染病 AIDS、SARS （分子分型） 302、疾病分

13、布规律以及危险因素致病机理的研究 分子流行病学不仅研究环境与宿主体内的致病因子，而且着重研究这些致病的危险因素，特别是化学物质与生物活性物质从暴露开始至疾病发生全过程的各个环节。 慢性非传染性疾病鉴定各种恶性肿瘤的危险因素, 并根据个体暴露与遗传等易感因素的相互作用, 确定危险度, 筛选对特定致癌因子敏感的个体和亚群。 传染病如确定风疹病毒（RV）和巨细胞病毒（CMV）等在人群中母婴传播的危害程度有多大，诱发畸形或死产、流产的危险度如何等。313 、疾病易感性的测定 在相同的致病因素作用下，只有一部分人发生某种疾病。这是因为人群对致病因子的反应存在个体差异，只有一部分人对其易感。 慢性非传染性

14、疾病肿瘤的遗传易感性在暴露到疾病发生的每一步都起作用，包括人群中较常见、低危险度的遗传多态性和高外显率、人群中罕见的抑癌基因突变。 传染病测定机体内是否存在某种特异性保护（中和）抗体的方法了解其对某种传染病是否具有易感性或免疫力 。324、防治效果评价传染病预防 提出的控制措施更有针对性，更有成效 基因工程疫苗研制 非传染病的预防 分子机理的探讨、易感标志物的确定，为筛选和确定高危险人群提供了科学依据，使慢性病的预防更具有针对性。 可以缩短效果评价周期!33 研究方法测量指标的一般原则生物标志应特异、稳定；标本采集、储存方便；检测方法比较简单、实用，而且操作规范，便于与同类研究结果比较。检测方

15、法灵敏度和特异度高。34常用的实验室检测技术核酸技术（DNA & RNA）核酸体外扩增 （PCR）核酸电泳图谱 核酸酶切电泳图谱 （RFLP）核酸分子杂交 有原位杂交、斑点杂交、转印杂交（包括Southern blot检测DNA和Northern blot检测RNA）等。核酸序列分析蛋白质技术 蛋白质分离鉴定技术主要有：电泳、凝胶电泳、蛋白质转印杂交（Western blot）、色谱分析、蛋白质测序等。酶学技术 包括定性和定量检测，要求一定的条件。多位点酶电泳（multilocus enzyme electrophoresis, MEE）法。其它技术 免疫学技术：酶联免疫吸附试验（ELISA）

16、、荧光免疫试验（FIA）、放射免疫试验（RIA）、免疫细胞化学检测（ICC）等； 色谱技术：高效液相色谱技术HPLC）、液相蛋白色谱技术（FPLC）等。35Automated Liquid HandlerSpectroPREPTMNanoliter DispenserSpectroJETTMMALDI-TOF Mass SpectrometerSpectroREADERTMAutomated AnalysisSpectroTYPERTMMiniaturized BiochipSpectroCHIPTMMassARRAYIntegrated Components36Blood Sample Pr

17、ocessing and Biomarker Assay Flow ChartPHASpinWhole blood short-term culture1ml1ml1mlMutagen sensitivityassayBPDE ControlBPDEGamma1mlBPDE-Induce DNA adducts assayDNAextraction1mlRT- PCR forgene expressionLong-termstoragecDNADNA1mlRNAextractionGenotypingLymphocyte isolation(frozen)CATassaysDNA repair

18、capacity2 mleachTransfectionHeparinized, 10-30 ml Sample collection(cases and controls)37实验室中的质量控制1一般实验质量控制 (1)标本采集和储存 (2)试剂和材料 (3)仪器 (4)实验方法 (5)操作规范2设立多重对照 为保证检测质量，可以设立多种对照，而且可以采取“盲法”。 (1)标准对照 (2)空白对照 (3)重复对照3重复试验 (1)实验室内重复试验 (2)实验室间重复试验38研究实例39年龄调整肺癌发病率 2002 (10万-1)Parkin et al. CA Cancer J Clin.

19、200540中国烟草生产及销售情况资料来源:中国烟草发展报告41Yang et al. JAMA 1999中国人群年龄和性别特异的吸烟率6.9 %60.2 %200135-74Gu et al. Am J Public Health 200410.6 %42性别特异的非吸烟者“二手烟”暴露情况2000-2001Gu et al. Am J Public Health. 2004 男性 女性43肺癌暴露非肺癌遗传易感性 ?科学问题：为什么仅10%的吸烟者发生肺癌？44Genetic SusceptibilityCancer RiskExposureGeneral populationSuscep

20、tibleHereditaryResistant45“Genetics loads gun, but Environments trigger.”4647Category of SNPsCoding SNPs (cSNPs): non-synonymous SNPs (nsSNPs) synonymous SNPs (sSNPs)Non-coding SNPs (ncSNPs): regulatory SNPs (rSNPs) Other intronic SNPs (iSNPs) rSNPs: located at 3UTR/5UTR, promoter region or exon-int

21、ron boundaryThe large number of other intronic SNPs! Only genetic marker?48Common genetic variants in miRNAs and flaking regionsHu Z, Chen J, Tian T, et al. JCI 2008PNAS 104(9):3300-3305,2007Hu Z, Chen J, Tian T, et al. JCI 2008Common Pre-miRNA SNPs and miRNA secondary structure prediction using Mfo

22、ld 3.2 4950Genotype-phenotype correlationHu Z, Chen J, Tian T, et al. JCI 200851Predicted targets of mir-196a2 3p and Report gene assaysMiRNAsGenes Full name or Alternative titlesP value3pLSP Lymphocyte-specific protein 12.73E-03KIFKinesin-like protein KIF2.89E-03PSMD1026S proteasome non-ATPase regu

23、latory subunit 102.92E-03BAG3BAG family molecular chaperone regulator 33.14E-03ALOX15Arachidonate 15-lipoxygenase3.25E-03Hu Z, Chen J, Tian T, et al. JCI 2008Pre-miRNAs SNPs and NSCLC patients survivalGenotypeTest Set, TSValidation Set, VSLog-rank P TS/VS/Merged A Adjusted HR B (95% CI) CPatients Deaths Patients Deaths (n = 556)(n=223)(n =