SiRNA稳定抑制肝癌细胞hTERT基因的表达

1、SiRNA稳定抑制肝癌细胞hTERT基因的表达【关键词】肝肿瘤StableinhibitinfhTERTgenebysiRNAinhepatarinaells【Abstrat】AI:TeluidatethetieeffiienyrelatinfstableinhibitinfhepatarinaellprliferatinbyRNAinterfereneinvitr.ETHDS:ThestablesreeninginhibitintehniquefRNAiasadptedtsuppresstheexpressinfhTERTstably.AftersallhairpinRNA(shRNA)ta

2、rgetinghTERTgeneasdesigned,rebinantvetrpGenesilshRNAhTERTasnstrutedandtransfetedinthepatarinaS7721ells,hiherestablyseletedbyG418testablishhepatarinaelllinesstablelyexpressingpGenesilshRNAhTERT.RealtieRTPR,TTandPRTRAPereutilizedtdetetthealteratinsfhTERTRNAexpressins,teleraseativityandellprliferatin.R

3、ESULTS:TheeffetivenessfRNAiexistedntinuallyandstablyinhepatarinaS7721ellsexpressingstablypGenesilshRNAhTERT.IntheelllinesexpressingstablypGenesilshRNAhTERT,hTERTRNAasbviuslysuppressed,andtheteleraseativitieseresignifiantlydereased.HepatarinaS7721ellprliferatinsignifiantlyinhibitedinpGenesilshRNAhTER

4、Tgrupparedtthatinnegativentrlgrup.NLUSIN:RNAiayntinuallyandstablysuppresshTERTRNAexpressinandarinaellprliferatin,hihisaptentialneapprahfrantiturgenetherapy.【Keyrds】RNAinterferene;liverneplass;telerase【摘要】目的：利用RNA干扰稳定挑选抑制技术，抑制人端粒酶逆转录酶hTERT基因表达，讨论靶向hTERT基因RNAi与抑制肝癌细胞增殖的时效关系.方法：设计靶向hTERT基因的小干扰RNA，构建重组表

5、达质粒pGenesilshRNAhTERT并导入肝癌S7721细胞株，经G418挑选，建立稳定表达siRNAhTERT的细胞株.采用realtieRTPR、TT和PRTRAP法同时检测pGenesilshRNAhTERT稳定抑制组和未处理S7721细胞组hTERT基因表达、端粒酶活性及细胞增殖变化.结果：在稳定表达pGenesilshRNAhTERT的S7721细胞株中，RNAi效力持续、稳定存在，hTERTRNA表达、端粒酶活性明显降低，瘤细胞增殖被抑制.结论：RNA干扰能持续、稳定地抑制靶基因hTERTRNA表达及肿瘤细胞增殖，是有潜力的基因治疗肿瘤新方法.【关键词】RNA干扰；肝肿瘤；端

6、粒，末端转移酶0引言端粒酶的异常表达与恶性肿瘤的发生开展和预后亲密相关1，hTERT基因在肝癌中的表达阳性率为89.5%2.研究说明hTERT的高表达能通过多分化刺激来抑制细胞凋亡，导致细胞永生化3.我们根据RNA干扰RNAinterferene,RNAi原理，使用短发夹样RNAsallhairpinRNA,shRNA设计的RNAiDNA载体方法4，以hTERT基因为靶点，构建稳定表达小干扰RNA(sallinterferingRNA,siRNA)的肝癌S7721细胞株，从体外研究siRNA稳定、特异诱导hTERT基因转录后沉默，逆转癌细胞恶性表型的才能，讨论RNAi基因治疗恶性肿瘤的时效性.

7、1材料和方法1.1材料肝癌S7721细胞株购自上海细胞生物研究所.质粒pGenesil1购自武汉晶赛生物工程技术.限制性内切酶BaH和Hind购自Rhe公司,总RNA提取试剂、转染试剂LipfetaineT2000等分别购自Takara和Invitrgen公司；端粒酶TRAPHybKit购自华美生物工程公司.Taqan探针和引物由Takara公司合成，hTERT及内参P的探针和引物序列参照文献4.siRNAhTERT转录模板由上海博亚公司合成.1.2方法shRNA发夹构造序列长度为69bp，两端分别为BaH,Hind酶切位点，中间为9bp茎环序列分隔的反向重复靶序列，并以6个T作为RNA聚合酶

8、的转录终止子.质粒构建采用BaH,Hind双酶切空质粒pGenesil1，将shRNAhTERT转录模板5AAGTTTGATGGTGATG3AF015950nuletides16821702和阴性对照转录模板5AAGTTATAAGGGATAG3与人基因无同源性分别设计成发夹构造，定向克隆至该载体上，经筛癣酶切鉴定后，进展测序确定，命名为pGenesilshRNAhTERT，阴性对照命名为pGenesilshRNAPK.质粒转染与G418挑选采用LipfetaineT2000脂质体转染法.操作按说明书进展，质粒脂质体=13.2k后可见长出挑选克隆.挑选克隆的鉴定：荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达

9、变化.分别搜集第一代稳定表达pGenesilshRNAhTERT和pGenesilshRNAPK的肝癌S7721细胞106个，进展RTPR扩增鉴定.1.2.1实时RTPR检测hTERTRNA表达实时PR反响体系25L，内含5realtiePRBuffer5L,300l/LdNTP,5l/Lgl2,hTERT上下游引物4各200nl/L，相应荧光探针120nl/L,Taq酶1.25U,DNA2L，水补齐到25L.953in后，按下述条件进展循环：9515s,6525s,40周期，每个样本设3个平行反响.换取引物和探针5，按前述同样条件进展内参照P编码人酸性核糖体磷酸蛋白的实时RTPR检测.结果数

10、据采用RtrGeneRealTieAnalysisSftare进展定量分析.hTERTRNA含量NhTERT标化以hTERT/P的相比照值来确定，其中hTERT为端粒酶逆转录酶基因的拷贝数，P为内参照基因拷贝数.1.2.2端粒酶活性检测采用PRTRAP法检测端粒酶活性，培养细胞106个经4000r/in离心10in，沉淀参加裂解液，取上清2L做TRAP反响模板.在PR反响管中各参加反响混合物45L，混匀，离心数秒，置25水浴30in.PR仪扩增，各孔参加杂交反响液反响，洗板，加显色剂A，B各1滴，37避光显色10in，加终止液，在酶标仪上450n/595n测得A值，判断端粒酶活性.1.2.3T

11、T实验搜集对数生长期未处理的以及稳定挑选的肝癌S7721，接种96孔板，细胞终密度为2104/孔，每个样本设3个平行孔，每孔总体系200L，试剂空白以无血清DE培养液补足.37,2孵箱中培养24h，在每孔中参加四甲基偶氮唑蓝TT，0.5g/L，继续培养4h，弃上清，参加二甲基亚砜200L，振荡5in，酶标仪570n读取A值.细胞增殖抑制率=1-实验组平均A值/对照组平均A值100%.统计学方法：数据用xs表示，采用SPSS10.0软件进展单因素方差分析.P0.05即认为有统计学差异.2结果重组质粒pGenesilshRNAhTERT和pGenesilshRNAPK经Hind和ER双酶切，同时做

12、pGenesil1空载体双酶切对照.20g/L琼脂糖电泳，pGenesil1空载体经双酶切后呈2条带，分别为4.54kb的载体片段和364bp的小片段；而重组质粒那么为4.54kb的载体片段和425bp的目的片段.测序结果均正确.质粒转染后在荧光显微镜下观察，可见转染后第1日镜下表现为少量亮堂的绿色荧光，主要位于细胞核内Fig1A；而稳定挑选建株后的S7721细胞镜下表现为大量亮堂的绿色荧光，同样位于细胞核内Fig1B.根据稳定挑选前后荧光蛋白表达变化可初步说明建株成功.对已转染pGenesilshRNAhTERT和pGenesilshRNAPK的肝癌S7721细胞，通过PR扩增，均可得到21

13、0bp的扩增产物Fig2，说明转染质粒DNA已整合到S7721细胞染色质上，稳定挑选建株成功.2.1实时RTPR检测hTERTRNA表达阴性对照pGenesilshRNAPK组与未处理S7721细胞组间无差异；pGenesilshRNAhTERT稳定抑制组中，检测第2代稳定建株后7d、第8代稳定建株后30d和第15代稳定建株后60d，发现与未处理S7721细胞组相比，hTERTRNA表达均明显降低，其差异具有统计学意义(P0.01,Tab1).表1实时荧光定量PR检测各组hTERTRNA表达略2.2端粒酶活性检测端粒酶活性以A值上下表示，对稳定表达pGenesilshRNAhTERT的S772

14、1细胞第2代、第8代和第15代分别设3个复孔进展检测，其吸光度均值分别为0.58,0.56,0.62,pGenesilshRNAPK组与未处理S7721细胞组吸光度均值分别为1.51和1.48，空白对照均值为0.06.可见稳定表达pGenesilshRNAhTERT的S7721细胞组端粒酶活性明显降低.2.3细胞增殖抑制实验pGenesilshRNAhTERT稳定抑制组中，第2代、第8代和第15代细胞增殖抑制率分别为49%,53%和50%，高于pGenesilshRNAPK组相应代别的细胞增殖抑制率5%,9%和7%.3讨论端粒酶全酶由端粒酶RNAhTR、端粒酶相关蛋白(TP1)和端粒酶催化亚基

15、hTERT三局部组成.其中hTERT是端粒酶全酶活性的限速因素，与肿瘤的关系更为亲密.资料显示hTERT基因在肝癌的表达阳性率约为89.5%2.我们利用RNAiDNA载体和瞬时转染技术，成功抑制了肝癌细胞中hTERT基因的表达，并在一定程度上逆转了肿瘤的恶性表型，但同时发现存在RNAi效力持续时间短的问题6.ThijnR等7使用pSUPER质粒长期、稳定地抑制了相关基因的表达.本研究中，我们所使用的pGenesil1质粒带有EGFP基因、U6启动子、G418抗性基因和卡那霉素抗性基因等，可进展稳定挑选.而EGFP基因、U6启动子由于启动方向相反而互不干扰，既可使shRNA进展正常的转录，在细胞

16、内诱导RNAi，同时对于质粒的转染以及稳定挑选都可通过绿色荧光蛋白表达而直观地监测.我们通过实时定量RTPR对稳定表达pGenesilshRNAhTERT的肝癌S7721细胞RNA进展了长时间60d的连续检测，发现hTERTRNA持续、稳定地被抑制，其抑制程度并不随时间而减弱.说明合理选择靶向hTERT的siRNA，通过shRNA表达载体的方法可对hTERT基因进展长期的稳定抑制.hTERT基因是合成端粒酶全酶的限速因素，其表达的下调势必会引起端粒酶活性的降低以及端粒缩短，破坏染色体稳定性而抑制细胞生长并促进细胞凋亡，逆转肿瘤细胞恶性表型8，我们通过检测端粒酶活性和对肿瘤细胞增殖的抑制也证实了

17、这点.本研究利用DNA载体RNAi技术对hTERT进展稳定抑制，构建了稳定表达pGenesilshRNAhTERT的肝癌S7721细胞株，发现pGenesilshRNAhTERT可持续、稳定地下调hTERTRNA表达，抑制端粒酶活性及肿瘤细胞增殖，逆转肝癌细胞的恶性表型，为肝癌基因治疗的临床应用开拓了新的思路.【参考文献】1杜辉，王健，郑维国，等.hTERT基因反义核酸对人卵巢癌细胞H8901存活才能的影响J.第四军医大学学报,2022;24(15):1362-1365.DuH,angJ,ZhenG,etal.EffetsfantisensenulEiaidsagainsthTERTRNAnv

18、iabilityfhuanvariananerH8910ellsJ.JFurthiledUniv,2022;24(15):1362-1365.2TakuaY,NusK,ShiratriY,etal.TelerasereversetransriptasegeneaplifiatininhepatellulararinaJ.JGastrenterlHepatl,2022;19(11):1300-1304.3Akiyaa,Yaada,KandaN,etal.TeleraseverexpressininK562leukeiaellsprtetsagainstapptsisbyserudeprivatinanddublestrandedDNAbreakinduingagents,butntagainstDNAsynthesisinhibitrsJ.anerLett,2002;178:187-197.4戴先文，王全平，李立文，等.RNAi法特异性抑制骨保护素配体J.第四军医大学学报,2022;