8生物样品内中药制剂化学成分的测定

1、第八章 生物样品内中药制剂化学成分的测定1 1 概述生物药物分析的对象药物所到之生物体的体液、器官、组织、排泄物等。生物药物分析的目标母体药物和代谢产物生物药物分析的意义药物质量的正确评价临床合理用药21 概述 生物药物分析的特点生物样品中被测组分的存在形式多样原型药（游离型）、结合型、代谢物、缀合物等被测组分浓度低(10-6-10-9g/ml)，变化幅度大样品干扰物质多，部分样品稳定差样品量少要求较快提供结果测定数据的处理和阐明有时不太容易31 概述 生物药物分析的任务分析方法学的研究药物浓度的监测药代动力学的研究生物样品内内源性物质的测定42 药物在生物体内的存在状态与生物转化药物在生物体

2、内的存在状态药物代谢保证临床用药的安全、合理和有效药物代谢的部位：肝脏、肾、脾、肺、肠粘膜、胎盘等药物代谢反应第一阶段（一相）：细胞色素P450等催化下的氧化、还原、水解等反应，增大极性第二阶段（二相）：与葡萄糖醛酸、硫酸盐等结合，进一步增大极性，随尿排出53 生物样品的制备 常用生物样品生物样品的选取原则能够反映出浓度与药效之间的关系易于获得便于处理根据不同目的和要求进行选取63 生物样品的制备 常用生物样品常用生物样品的种类、特点与采集 血浆(plasma)血样 血清(serum) 全血(whole blood)尿液(urine)用于药物剂量回收、药物肾清除率及生物利用度的研究 尿液药物浓

3、度变化大，应测定一定时间内尿中药 物总量。 尿液与血液中药物的相关性差。 尿中药物大多呈缀合状态。73 生物样品的制备 常用生物样品常用生物样品的种类、特点与采集唾液(saliva)用于药物浓度监测和药代动力学研究其他动物脏器组织匀浆等样本的代表性力求取样条件标准化样品的贮存血样离心，冷冻保存尿液立即测定，否则应冷藏或加防腐剂83 生物样品的制备 样品预处理提取方法的选择依据药物的理化性质-酸碱度、极性、挥发性、可能的生物转化途径等药物的浓度范围药物测定的目的生物样品的类型样品处理与分析技术的关系93 生物样品的制备 样品预处理药物的提取蛋白质处理利用蛋白质脱水沉淀有机溶剂、中性盐等利用蛋白质

4、形成不溶性盐沉淀酸性沉淀剂（TCA、高氯酸、苦味酸等）重金属盐（Zn2+、Cu2+）103 生物样品的制备 样品预处理药物的提取蛋白质处理其他方法加热离心、超滤和透析分析游离的待测组分酶消化法分析与蛋白质强结合的待测组分113 生物样品的制备 样品预处理药物的提取缀合物（结合物）水解酸水解无机酸 简便快速，但专属性差，有可能造成被测物分解。酶水解葡萄糖醛酸苷酶(glucuronidase)芳基硫酸酯酶(arylsulfatase) 专属性强，一般不会造成被测物分解，但水解时间长，费用高。溶剂解123 生物样品的制备 样品预处理药物的提取冷冻干燥适用于-大批量的生物样品-水溶性很强的样品-挥发性

5、样品-对热不稳定的样品133 生物样品的制备 样品预处理药物的分离与净化液-液萃取萃取率：不低于50%影响提取率的因素pH值提取溶剂离子强度离子对提取143 生物样品的制备 样品预处理药物的分离与净化液-固萃取固相提取柱（使用硅藻土、氧化铝、离子交换树脂、活性炭等填充剂）“干混合物”萃取待测组分的富集真空挥发或通气流挥发衍生化处理153 生物样品的制备 样品预处理待测物的损失吸附、化学降解、衍生化反应、络合、蒸发样品玷污增塑剂脂肪酸和酯类其他164 生物样品内药物分析方法分析方法建立的一般步骤 以纯品进行测定 确定线性范围、最适测定浓度、灵敏度、最佳测定条件等空白样品测定以水代替空白样品，添加

6、对照品后测定 了解提取回收率和最低检测浓度的大致情况空白样品中添加对照品后测定（回收率实验）实际样品测定174 生物样品内药物分析方法 方法的评价准确度（accuracy）回收率相对稳定与参比方法相比较相关系数r 0.95精密度（precision） 各浓度点RSD不应大于15%，最低定量限不应大于20%。灵敏度检测限(LOD)、定量限(LOQ)、最低检测浓度184 生物样品内药物分析方法 方法的评价方法的专属性（specificity） 注重考虑代谢物、内源性物质和同时服用药物的干扰线性范围-相关系数r 0.99 样品稳定性考察长期贮存(-20 /-70)、短期室温贮存冷冻-解冻循环稳定性贮

7、备液稳定性195 生物药物分析的常用测定方法 光谱法紫外可见分光光度法荧光分光光度法色谱法电泳法免疫分析法206 应用实例人尿中槲皮素含量测定 取15mL氩气消泡后的尿液，用0.12mol/L醋酸盐(含1%抗坏血酸)调尿液pH至5，样品中加入1g漆树黄酮做内标，用葡萄糖醛酸苷酶/芳基磺胺酶在37温孵1h震荡水解，取500mg反相C18填料，甲醇湿润装柱，随后用1%甲酸5mL平衡ODS柱，酶解后的尿液上样，流速为5mL/min左右，用3mL5%甲醇和3mL90%甲醇(含1%甲酸和1%抗坏血酸)洗脱，最后用3mL甲醇洗脱。馏分合并，真空吹干，残渣用150uL甲醇复溶后进样。NielsenSE, e

8、t al. J Chromatogr (B),1998,707(2):81289121五灵胶囊中五味子乙素在小鼠体内药代动力学研究色谱条件：KromasilC-18色谱柱 (4.6mm150mm,粒度:5um); 流动相为甲醇-水(80:20); 流速1.0mlmin; 检测波长254nm; 柱温为室温。给药方法：昆明小鼠456只，雄性，置相对湿度45%75%、温度(251)动物试验室饲养3d，禁食过夜，自由饮水，次日按体重分层，随机分组，每时间点为一组，每组4只，五灵胶囊按16.6g/kg (相当于人体给药剂量10倍,其中含五味子乙素45.0mg)给药,分别在0.16, 0.32, 0.5,

9、 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5 ,5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 10.0, 12.0, 14.0, 18.0, 20.0, 24.0, 26.0, 28.0, 32.0h眼眶采血，置于肝素钠的离心管内，室温放置30min，3000rmin离心10min,分离血浆,每组血浆合并置-20冻存。乙素供试品按45.0mg/kg给药,分别在0.16, 0.32, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 6.0, 8.0, 10.0h采血，同上法操作得血浆，-20冻存。22五灵胶囊中五味子乙素在小鼠体内药代动力学研究血浆供试品溶液、血浆乙素供试品溶液与阴性供试品溶液的制备 取上述依时间点取每组小鼠混匀血浆0.7ml，分别加0.25g硫酸胺，振荡混匀1min，再加乙腈-甲醇(4:1)溶液4ml，振荡混匀3min，3000rmin离心20min，取上清液置蒸发皿内，于40水浴上用氮气吹干，残渣加色谱甲醇溶解至1ml，摇匀，-20放置过夜。次日用0.22Lm微孔滤膜抽滤，作为血浆供试品溶液。取上述乙素供试品依时间点取每组混匀血浆0.7ml，按供试品溶液的制备方法制得血浆乙素供试品溶液,另取五灵胶囊缺五味子阴性样品和供试品