07微生物遗传变异与育种

1、第七章 微生物的遗传变异与育种 学习目标：1.掌握生物体的遗传物质及存在水平；2.理解质粒的概念，了解常见的质粒；3.理解基因突变的概念、类型与特点；4.了解菌种衰退的防止方法与复壮方法；5.了解菌种保藏的原理与常见保藏方法。11、理想的工业发酵菌种应符合以下要求：遗传性状稳定；生长速度快，不易被噬菌体等异种微生物污染；目标产物的产量尽可能接近理论转化率；目标产物最好能分泌到细胞外，以降低产物抑制并利于分离；尽可能减少产物类似物的产量，以提高目标产物的产量并利于分离；培养基成分简单、来源广、价格低廉；对温度、pH、离子强度、剪切力等环境因素不敏感；对溶氧的要求低，便于培养及降低能耗。2 微生物

2、是研究现代遗传学和其它许多主要的生物学基本理论问题中最热衷的研究对象。 对微生物遗传规律的深入研究，不仅促进了现代分子生物学和生物工程学的发展，而且为育种工作提供了丰富的理论基础，促使育种工作从不自觉到自觉、从低效到高效、从随机到定向、从近缘杂交到远缘杂交的方向发展。2、研究微生物遗传学的意义33、遗传与变异的概念遗传和变异是生物体的最本质的属性之一。遗传(heredity)：亲代生物的性状在子代得到表现；亲代生物传递给子代一套实现与其相同形状的遗传信息。特点：具稳定性。遗传型（genotype）：又称基因型，指某一生物个体所含有的全部基因的总和；是一种内在可能性或潜力。 遗传型 + 环境条件

3、 表型表型（phenotype）：指生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总和;-是一种现实存在，是具一定遗传型的生物在一定条件下所表现出的具体性状。代谢发育4变异(variation):生物体在外因或内因的作用下，遗传物质的结构或数量发生改变。变异的特点：a.在群体中以极低的几率出现，（一般为10-610-10）；b.形状变化的幅度大；c. 变化后形成的新性状是稳定的，可遗传的。饰变（modification）：指不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、转译水平上的表型变化。特点是：a.几乎整个群体中的每一个个体都发生同样的变化；b.性状变化的幅度小；c.因遗传物质不变，故饰变是不遗传的。引起

4、饰变的因素消失后，表型即可恢复。5第一节 遗传变异的物质基础（一）经典转化实验（transformation） F.Griffith，肺炎双球菌转化实验。（二）噬菌体感染实验（三）植物病毒的重建实验一、证明核酸是遗传物质基础的三个经典实验6核酸存在的七个水平细胞水平：存在于细胞核或核质体，单核或多核细胞核水平: 原与真核生物的细胞核结构不同，核外DNA染色体水平: 倍性(真核)和染色体数。核酸水平：在原核中同染色体水平、存在部分二倍体 DNA或RNA，复合或裸露，双链或单链。基因水平：具自主复制能力的遗传功能单位，长度与信息量，转录翻译密码子水平：信息单位,起始和终止,核苷酸水平：突变或交换单

5、位，四种碱基。二、遗传物质在细胞内的存在部位和方式7三、原核生物的质粒1、质粒基础知识定义：是一类小型闭合环状核外双螺旋DNA分子，能独立于细胞核进行自主复制。大小：约为2-100106Dalton，上面携带有数个到数十个甚至上百个基因。8性质：可以在细胞质中独立于染色体之外独立存在（游离态），也可以通过交换掺入染色体上，以附加体的形式存在；质粒是一种复制子，根据自我复制能力的不同，可把质粒复制的控制形式分为严紧型和松弛型两种。 可以通过转化、转导或接合作用而由一个细菌细胞转移到另一个菌细胞中，使两个细胞都成为带有质粒的细胞；质粒可以单独转移，也可以携带着染色体（片段）一起进行转移，所以它可成

6、为基因工程的载体。对于细菌的生存并不是必要的。功能多样化。9功能：进行细胞间接合，并带有一些基因，如产生毒素、抗药性、固氮、产生酶类、降解功能等。重组：在质粒之间、质粒与染色体之间菌可发生。存在范围：很多细菌如E.coli、lactis、根癌土壤杆菌等。制备：包括增殖、裂解细胞、分离质粒与染色体和蛋白质等成分、去除RNA和蛋白质等步骤。鉴定：电镜观察、电泳、密度梯度离心、限制性酶切图谱等方法102、几种代表性质粒（1）F-因子：又称致育因子或性因子。存在于肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、奈瑟氏球菌、链球菌等细菌中，决定性别。（2）R因子：即抗性转移因子和抗性决定R因子。其上带有其它抗生素的抗性

7、基因，也称耐药性质粒。该因子首先是在志贺氏菌中发现。11（3）Ti质粒：即诱癌质粒。存在于根癌土壤杆菌中,可引起许多双子叶植物的根癌。当前，Ti质粒已成为植物遗传工程研究中的重要载体。（4） Col因子：产大肠杆菌素因子。大肠杆菌素是由E.coli的某些菌株所分泌的细菌素，能通过抑制复制、转录、转译或能量代谢等而专一地杀死其它肠道细菌。 凡带Col因子的菌株，由于质粒本身编码一种免疫蛋白，从而对大肠杆菌素有免疫作用，不受其伤害。12（5）降解性质粒：只在假单胞菌属中发现。它们的降解性质粒可为一系列能降解复杂物质的酶编码，从而能利用一般细菌所难以分解的物质做碳源。这些质粒以其所分解的底物命名。（

8、6）巨大质粒：是近年来在根瘤菌属）中发现的一种质粒，分子量为200-300106Dalton，比一般质粒大几十倍到几百倍，故称巨大质粒，其上有一系列固氮基因。13第二节 基因突变突变（mutation）：指生物体表型突然发生的可遗传变化。 染色体畸变细胞学上可以看到染色体的变化。 突变 包括：缺失添加（重复、插入）易位倒位 。 基因突变细胞学上看不到遗传物质的变化。 包括：碱基置换（转换、巅换）； 移码突变（缺失、添加） 。突变体：发生了突变的微生物细胞或菌株野生型：从自然界分离到的任何微生物在其发生突变前的原始菌株。14依表型的改变分为：形态突变型营养缺陷型因突变而丧失产生某种生物合成酶的能

9、力，并因而成为必须在培养基中添加某种物质才能生长的突变类型。发酵突变型丧失产生某种生物合成酶能力的突变型。抗性突变型因突变而产生了对某种化学药物或致死物理因子的抗性。条件致死突变型突变后在某种条件下可正常生长繁殖，而在另一条件下却无法生长繁殖的突变型。抗原突变型因突变而引起的抗原结构发生改变。产量突变型一、基因突变的类型15依突变发生方式分为： 1、自发突变：环境因素的影响，DNA复制过程的偶然错误等而导致。一般频率较低，通常为106-109 。2、诱变：某些物理、化学因素对生物体的DNA进行直接作用，突变以较高的频率产生。这些理化因素称为诱变剂。16按是否比较容易、迅速地分离到发生突变的细胞

10、来分：选择性突变株（selective mutant）：具有选择标记（如营养缺陷性、抗性突变型、条件致死突变型），只要选择适当的环境条件，如培养基、温度、pH值等，就比较容易检出和分离到。非选择性突变株（non-selective mutant）：无选择标记（如产量突变型、抗原突变型、形态突变型），能鉴别这种突变体的惟一方法是检查大量菌落并找出差异。17二、突变的特点适用于整个生物界，以细菌的抗药性为例。不对应性：突变的性状与突变原因之间无直接的对应关系。自发性：突变可以在没有人为诱变因素处理下自发地产生。稀有性：突变率低且稳定。独立性：各种突变独立发生，不会互相影响。可诱发性：诱变剂可提高突

11、变率。稳定性：变异性状稳定可遗传。可逆性：从原始的野生型基因到变异株的突变称为正向突变，从突变株回到野生型的过程则称为回复突变 或回变。18三、基因突变的机制本部分内容课内不进行介绍，有兴趣可以自学。P111.19第三节 基因重组 凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式，称为基因重组（gene recombination）或遗传重组，简称重组。 重组可使生物体在未发生突变的情况下，也能产生新遗传型的个体。 重组与杂交的关系：重组是分子水平上的一个概念，可以理解成是遗传物质分子水平上的杂交。而一般所说的杂交则是细胞水平上的一个概念。杂交中必然

12、包含着重组，而重组则不限于杂交这一形式。20一、原核微生物的基因重组基因重组的方式转化转导接合原生质体融合21 R型活菌+S型死菌 S型活菌定义：受体菌自然或在人工技术作用下直接摄取来自供体菌的游离DNA片段，并把它整合到自己的基因组中，而获得部分新的遗传性状的基因转移过程，称为转化。转化后的的受体菌称为转化子（transformant）。有关名词：受体菌：recipient/receptor，转化基因的接受者供体菌：donor，转化基因的提供者转化因子：来自供体菌的DNA片段转化子：transformant，将转化基因重组进入自身染色体组的重组子（一）转化（transformation）1、

13、转化22 受体细胞要处于感受态.感受态：competence，受体细胞能从环境吸取外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态供体DNA片段（转化因子）大小适宜，分子量一般为1 107 D 左右 菌株间的亲缘关系密切2、转化发生的条件3、转化的类型根据感受态建立的方式，可以分为：自然遗传转化人工转化23（二）转导（transduction）细菌细胞间进行遗传交换的另一种方式，指通过缺陷噬菌体的媒介，将供体细胞的小片段DNA携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传性状的现象。 1.转导转导子：由转导作用获得部分新性状的重组细胞。转导噬菌体：能将一个宿主（细菌）的部分染色体或质粒DNA

14、带到另一个宿主（细菌）的噬菌体。242.转导的种类普遍转导（generalized transduction）：通过少数完全缺陷噬菌体对供体菌基因组上任何小片段进行“误包”而将其遗传性状转移给受体菌的现象。 局限性转导：也称局限转导，指通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并与后者的基因整合、重组形成转导子的现象。 溶源转变：当温和噬菌体感染宿主而使其发生溶源化时，因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上，而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象，称为溶源转变。25（三）接合（conjugation）定义：供体菌（“雄”）通过其性菌毛与受体菌（“雌”）相接触，前者传递不同长

15、度的DNA给后者，并在后者细胞中进行双链化或进一步与核染色体发生交换、整合，从而使后者获得供体菌的遗传性状的现象，称为接合。通过接合而获得新性状的受体细胞就是接合子（conjugant）存在范围：细菌：G 较为多见如E. coli等最为常见。放线菌：Streptomyces 、Nocardia。接合还可发生在不同属的菌种之间。E. coli的F因子：决定性别的质粒，属于附加体（episome），可以通过接合作用获得，也可以通过丫啶类化合物、溴化乙锭或丝裂霉素C的处理而消除。26（四）原生质体融合protoplast fusion概念：通过人为方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并进

16、而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（fusant）的过程，称为原生质体融合。适用范围：各种生物细胞都能进行原生质体融合，包括各种原核生物、真核微生物以及高等动植物和人体的不同细胞。意义：70年代后发展的一种育种新技术，继转化、转导和接合之后一种更有效的转移遗传物质的手段。原生质体融合不仅能在不同菌株或种间进行，还能做到属间、科间甚至更远缘的微生物或高等生物细胞间的融合。27原生质体融合的优点： 可以提高重组率 双亲可以少带标记或不带标记 可进行多亲本融合 有利于不同种间、属间微生物的杂交 通过原生质体融合提高产量 发展点：有关原生质体融合的遗传机制，尚未研究清楚，目前还在

17、探索中。28二、真核微生物的基因重组主要方式：有性杂交准性杂交原生质体融合（略）转化（略）29（一）有性杂交 一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组，并产生新遗传型后代的过程。 凡是能产生有性孢子的酵母菌或霉菌，原则上都能采用与高等动、植物杂交育种相似的有性杂交方法进行育种。（二）准性杂交 类似于有性生殖但更原始的生殖方式，是通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合，不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子。 为半知菌育种提供了一个重要手段。 存在范围：常见于一些真菌尤其是半知菌中。30第四节 微生物育种 利用微生物遗传变异的特点，应用诱变、杂交、原生质体融合及基因工程等方法获得所需

18、的具有某些新型性状菌种的操作称为微生物育种。 包括： 诱变育种 原生质体融合育种 基因工程育种等311、诱变育种 是用物理或化学的诱变剂使诱变对象内的遗传物质（DNA）的分子结构发生改变，引起性状变异并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。 诱变育种具有极其重要的实践意义。当前发酵工业和其他微生物生产部门所使用的高产菌株，几乎毫无例外地都是通过诱变育种而明显提高其生产性能的。一、诱变育种32 2、诱变育种的步骤原始菌种纯化斜面/肉汤培养单孢子/单细胞悬液诱变剂处理平板分离移至斜面小试中试初筛复筛计算存活率观察形态变异，挑单菌落良种保藏原菌种特性鉴定333、诱变育种的基本过程选择选择合适

19、的出发菌株制备待处理的菌悬液诱变处理筛选保藏和扩大试验34二、原生质体融合育种三、基因工程育种 本部分内容自学，P120。351.衰退（degeneration） ：菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退。衰退的原因：基因突变，分离现象。常见的衰退现象：菌落和细胞形态的改变； 生长速度缓慢，产孢子越来越少； 抵抗力、抗不良环境能力减弱等。代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降；第五节 菌种的衰退、复壮及保藏一、菌种的衰退与复壮362、菌种的复壮（rejuvenation）：使衰退的菌种恢复原来优良性状。 狭义的复壮是指在

20、菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施。 广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用自发突变（正变）不断地从生产中选种。37 菌种的复壮措施：纯种分离：（平板划线法、涂布法、倾注法、单细胞挑取法等）。 通过寄主体内生长进行复壮（如Bacillus thuringiensis的复壮） ； 淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进行处理，以杀死生命力较差的已衰退个体）。采用有效的菌种保藏方法。383、防止菌种衰退的方法： 控制传代次数（一般在DNA的复制过程中，碱基的错配率是5x10-4，自发突变的频率为10-810-9，采用良好的菌种保藏方法，可以减少移种和传代的数）； 选择合适的培养条件； 采用不同类型的细胞进行传代（对丝状微生物而言，通常采用稳定的单核孢子进行接种）； 采用有效的菌种保藏方法。39 1. 目的：存活，不丢失，不污染； 防止