与肺癌源性HSP70特异性结合单链融合抗体的筛选与序列分析

1、与肺癌源性HSP70特异性结合单链交融抗体的挑选与序列阐发杨继要,张慧珍,王静,吴逸明,买淑鹏【摘要】目的从人源性肺癌噬菌体单链抗体库中挑选与肺癌源性HSP70特异性结合的交融抗体。要领以肺癌源性的HSP70为抗原,对人源性肺癌噬菌体单链抗体库中经四轮挑选,单克隆噬菌体抗体与抗原HSP70结合经ELISA检测挑选出阳性菌株，再经PR进一步断定，确定含有单链抗体基因的克隆并测序，测序效果通过GeneBank比对举行同源性阐发。效果得到了1个特异性强的阳性噬菌体克拢经DNA测序后,在Genebank中与人的免疫球卵白库举行比对,确定为单链抗体片断。结论从人源性肺癌噬菌体单链抗体库中挑选到与HSP7

2、0特异性结合的具有成效活性的单链交融抗体,为进一步的HSP70可溶性抗体的制备以及以可溶性HSP70抗体为载体的药物导向抗肿瘤治疗奠基了基矗【关键词】肺癌；噬菌体抗体库；HSP70；挑选IdentifiatinandSequeneAnalysisfFusedsFvAntibdyBindingSpeifiallytHSP70Keyrds：Lunganer；Phageantibdylibrary；HSP70；Bipanning热休克卵白70HeatShkPrtEin70,HSP70在许多肿瘤中高表达，研究表白1，2，肿瘤细胞的HSP70特异性表达于细胞外貌，与正常构造细胞的细胞内表达差异。本研究从

3、构建的人源性肺癌噬菌体单链抗体库中挑选抗HSP70抗体，旨在探求有临床应用代价的抗体，为肺癌免疫治疗奠基理论基矗1质料和要领1.1质料人源性肺癌噬菌体单链抗体库由我室张慧珍博士构建，库容为1.21012，-70保存。TG1大肠杆菌、K13帮助噬菌体为本实行保存。鼠抗13单克隆抗体购自Aersha公司。鼠抗人HSP70一抗、兔抗鼠二抗购自北京中山公司，抗原HSP70由我研究室从肺癌构造中提取总卵白，颠末nA亲和柱、透析、DEAE离子互换柱得到，经ESTERN-BLT断定具有抗原性。胰酶及其他试剂为国产阐发纯。1.2要领(1)噬菌体抗体库的扩增取100l原库菌液，接种到100l2YT-AG含100

4、g/l氨苄青霉素，1%葡萄糖的2YT造就基中，37振荡造就至D6000.4；加1l帮助噬菌体K13于25l造就液，37水浴30in，4离心后弃上清；用50l2YT-AK含100g/l氨苄青霉素，50g/l卡那霉素的2YT重悬沉淀，37造就留宿；4离心，上清即为扩增后的噬菌体抗体库。加10lPEG/Nal于上清中，冰浴1h后离心弃上清，用PBS洗涤沉淀，再重悬于含15%甘油的PBS中，-70保存。(2)抗体库滴度测定取1l浓缩后的抗体库上清，用PBS100倍梯度稀释，每个稀释度均参加900l奇怪制备的大肠杆菌TG1D6000.4，37水浴30in后涂TYE平板，37造就留宿。越日计数菌落预计噬菌

5、体抗体滴度：用噬菌体颗粒的菌落形成单元表现，pfu/l集落数稀释倍数。定量稀释到11012pfu/l保存。(1)从单个含噬菌粒细菌克隆制备交融抗体从每一轮挑选后留宿造就的TYE平板上随机挑取12个单个细菌克隆，接种到含200l2YT-AG的酶标板孔中，37振荡造就留宿，标识表记标帜为母板；另取一块酶标板，标识表记标帜为检测板，每孔加200l2YT-AG，从母板中取10l留宿造就物于检测板相应孔中，37振荡造就1h；每孔参加1l帮助噬菌体K13，37振荡造就1h。离心弃上清，每孔加200l2YT-AK，造就留宿，离心，上清即外貌表达有交融抗体的单克隆噬菌体，4保存。(2)单克隆噬菌体与HSP70

6、结合的ELISA检测抗原HSP70包被酶标板操纵同上，向每孔加50l单克隆噬菌体抗体上清液，2%PBS洗涤后，参加二抗HRP-anti-13；阳性比拟为一抗鼠抗人HSP70，二抗兔抗鼠lgG；阴性比拟仅参加2%PBS。以TB为底物,2硫酸停顿反响,取经酶标仪检测D405D630的均匀值，以D值大于阴性比拟均匀值的2倍,断定为阳性。2效果21低级噬菌体抗体库滴度含重组噬菌粒的库容为1.21012的抗体库经K13帮助噬菌体帮助熏染后，得到表达交融抗体的低级噬菌体抗体库，滴度为4.21016pfu/l。2.2噬菌体淘洗产率以纯化的肺癌相干卵白HSP70为抗原举行了四轮“吸附洗脱扩增的挑选，洗脱的噬菌

7、体产率表现第四轮与第三轮的接纳率相近,说明颠末挑选后阳性克隆已得到富集,见表1。表1各轮挑选历程中噬菌体的接纳率挑选次数投入量产出量接纳率%14.210138.01021.910-922.410132.01058.310-733.010134.21061.410-544.010137.21061.810-5注：接纳率(%)=投入噬菌体量/产出噬菌体量100%2.3单克隆噬菌体抗体与HSP70结合的ELISA检测效果从四轮中每轮随机挑取12个单细菌克隆制备噬菌体交融抗体，与包被的HSP70抗原反响经ELISA检测，共得到5个阳性克隆第一轮0个，第二轮1，第三轮1个，第四轮3个。2.4阳性克隆菌的

8、质粒PR断定效果5个阳性菌经质粒提取后行PR扩增,经凝胶电泳,可见只有1个克隆片断为800bp摆布,切合抗体片断的理论值,见图1。2.5单链抗体DNA序列阐发效果将挑选出的1个单克隆菌交上海基康生物公司接纳通用引物LB3测序,所得序列在GeneBank中举行比拟,结图1质粒PR电泳断定图果表白该克隆含有人类免疫球卵白同源序列,测序效果(VH+Linker+VL)如下,下划线部门为Linker。3讨论近几年来随着更多肿瘤相干抗原的创造，基因工程抗体技能的日渐美满，新一轮以抗体为导向的肿瘤治疗又开始备受存眷3。20世纪90年代初,人们将噬菌体展示技能应用于抗体克隆和表达,使抗体的制备技能产生打破性

9、的希望4，5，与传统的杂交瘤技能比拟,噬菌体展示技能挑选容量大，轻便，易于举行抗体的改革，而且不需经免疫即可大量制备抗体，因此在肿瘤的诊断和治疗，肿瘤疫苗研制方面应用远景辽阔6。HSP70在许多人类肿瘤构造细胞中均有较高的表达，肿瘤泉源的HSP70诱导的抗肿瘤免疫是当前研究的热门。以往的研究表白2，7，HSP70引发有用抗肿瘤免疫效应的抗原性泉源于它所结合的多肽，而不是HSP70自己。但是，按照肿瘤细胞的HSP70特异表达于细胞外貌，而正常细胞那么是细胞内表达的特性，作者推测，可以使用该特性，制备肿瘤源性的HSP70抗体，使HSP70可作为肿瘤相干抗原而不是仅仅作为“肿瘤抗原载体大概“免疫佐剂来诱导的抗肿瘤免疫，成为以HSP70为底子的肿瘤靶向治疗的另一个切入点。本研究作为先期研究事情，以肺癌构造中纯化出的具有抗原活性的HSP70作为抗原，从人源性肺癌噬菌体单链抗体库中挑选HSP70抗体，经四轮挑选，得到富集后的噬菌体抗体库。从四轮随机挑取的48个菌落中，经单克隆噬菌体抗体与HSP70结合的ELISA检测出中断定5个含单链交融抗体的阳性克隆，经随后的PR断定，在1株阳性克隆中得到与理论值同