昆虫抗性监测与治理-11ppt课件

1、昆虫抗性监测与治理唐振华中国科学院上海生命科学研讨院植物生理生态研讨所.内 容昆虫抗药性及其现况抗药性机理及其分子根底抗性早期诊断技术抗性治理战略我们在该领域的研讨进展展望.抗药性 昆虫具有耐受杀死正常种群大部分个体的药量的才干在其群体中开展起来的景象。也就是说，在多次运用药剂后，害虫对某种药剂的抗药力较原来正常情况下有明显添加的景象，其特点是这种由运用药剂而增大的抗药力，是可以遗传的。有些昆虫对某些杀虫剂表现一种天然的敏感度低，即具有高度耐受性，我们把这种先天性的抗药才干称为自然抗性(nature resistance) 1.昆虫抗药性及其现况.交互抗性 昆虫对一种药剂发生抗性后往往对其它没

2、有运用过的药剂也发生抗性，这叫做“交互抗性(cross resistance)。普通来讲，作用机理机同的杀虫剂易产生交互抗性。由于产生交互抗性的缘由主要是由某些杀虫剂的作用机理或代谢机理类同所致。也就是说，由于其抗性机理一样可对不同杀虫剂产生交互抗性。1.昆虫抗药性及其现况.负交互抗性 负交互抗性(negative cross resistance)是指昆虫对一种杀虫剂发生抗性后对另一种杀虫剂的敏感度反而上升的景象。1.昆虫抗药性及其现况.多种抗性 多种抗性(multiple resistance)指昆虫对同时运用的几种杀虫剂产生抗性的景象，但这种抗性对几种杀虫剂的维护机制是不同的，切勿与交互

3、抗性相混淆。区别这两种抗性是很重要的，由于一个特殊的交互抗性型常能提供与抗性机制有关的信息。1.昆虫抗药性及其现况.抗性开展的现况 据不完全统计至2003年，已报道对杀虫剂和杀螨剂产生抗性的昆虫和螨有548种，抗性虫种分布于15个不同的目：蜱螨目、蛛形目、鞘翅目、革翅目、双翅目、蝣目、半翅目、同翅目、膜翅目、鳞翅目、脉翅目、直翅目、虱目、蚤目和缨翅目，其中最多的是双翅目、蜱螨类、鳞翅目、鞘翅目和同翅目昆虫，这5个目的抗性虫种约占全部抗性虫种的90%以上。其中对杀虫剂和杀螨剂产生抗性最多的虫种是蝇、蚊，其次为螨、蜱、蝶，蛾、甲虫和半翅目昆虫(包括蚜虫、蝉、叶蝉、飞虱、介虫和粉虱)。自20世纪60

4、年代发现害虫和害螨的抗药性以来，具有抗性药性的害虫和害螨种类数量在不断地添加，特别是在70年代以后，20世纪昆虫和螨类产生抗性的情况见 以下图1.昆虫抗药性及其现况.抗性事例数(虫种化合物)昆虫和螨的种类数杀虫剂和杀螨剂化合物数 在昆虫和螨中报告产生抗性的增长情况 1.昆虫抗药性及其现况.orderNumber of resistant species Percent of total number of resistant species548Diptera 18434Acari8315Lepidoptera8215Coleptera7313Homoptera5811total48088 M

5、ost resistant arthropod orders to insecticides or acaricides1.昆虫抗药性及其现况.Most resistant arthropod species to insecticides or acaricides Species Number of pesticides Tetranychus urticae72Plutella xylostella69 Myzus persicae68 Boophilus microplus41 Leptinotarsa decemlineata40 Panonychus ulmi40 Blattell

6、a germanica39 Heliothis virescens37 Musca domestica36 Tribolium castaneum341.昆虫抗药性及其现况. 杀虫剂的作用及抗性机理 、表示杀虫剂抗性的主要机理 2. 抗药性机理及其分子根底. 昆虫运用的各种反响，具有代谢各种有机化合物的才干。它们的代谢物通常具有更大的亲水性(普通低毒或无毒)，这样易于排出体外。许多抗性昆虫抵抗杀虫剂的才干明显添加，加速代谢杀虫剂，使这些杀虫剂变为无毒或低毒化合物，从而使杀虫剂无法到达作用部位，由此而产生的抗性称为代谢抗性(metabolic resistance)这是昆虫的一种重要抗性机理。这

7、类代谢才干增高是由于解毒酶的上调理(up-regulation)所致。这种上调理的添加可由细胞色素P450s和/或GSTs的转录过表达，或由水解酶基因的扩增所致。 代谢抗性2. 抗药性机理及其分子根底.代谢抗性相关的三大酶系酯酶EstP450单加氧酶(P450s) ，又称多功能氧化酶(MFOs)谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)2. 抗药性机理及其分子根底.代谢抗性的分子机理 尖音库蚊(Culex pipiens)对有机磷杀虫剂的抗性主要涉及3个等位基因，其中2个基因座为Est-2(或酯酶B)和Est-3(或酯酶A)，它们是编码解毒羧酸酯的水解酶的酯酶基因，赋予酯酶过量产生的抗性等位基因。至今在酯

8、酶B基因座发现有6个不同的同种异酶(allozymes)：B1、B2、B4、B5、B6和B7；在酯酶A基因座有4个不同的同种异酶：A1、A2、A4和A5。这2个酯酶基因座是严密连锁的，之间由26 kb的基因间隔的DNA片段把它们分隔开。同种异酶是指一样基因位点上不同等位基因所编码的不同方式的酶。第三个基因座是Ace1，编码乙酰胆碱酯酶，是一个敏感度降低不敏感的等位基因。2. 抗药性机理及其分子根底. 与杀虫剂的结合才干的添加, 从而减少到达靶标部位杀虫剂的量 加速杀虫剂的代谢。抗性昆虫中的酯酶量的改动2. 抗药性机理及其分子根底.酯酶的过量的分子机理酯酶的过量产生是由2种独立的机理引起的。第一

9、种机理是基因扩增，既可是酯酶B基因座扩增，又可是酯酶A基因座扩增，在某些情况下还可是酯酶A和B基因座一同扩增。后者是2个酯酶基因座共扩增(co-amplification)。 第二种机理为基因调理(gene regulation)，用以解释酯酶A1的过量产生。但是，除了基因扩增外，还有基因调理可奉献于其他变异体的过量产生。 2. 抗药性机理及其分子根底.抗性昆虫中的酯酶质的改动 与有机磷抗性相关的酯酶除了量的变化外，还存在质的变化。这种质的变化的根底能够涉及酯酶的构造改动，从而添加其降解杀虫剂的才干例如:家蝇和铜绿蝇中色氨酸(Try)突变为亮氨酸(Leu )2. 抗药性机理及其分子根底.在抗性

10、昆虫中P450的过表达 抗性虫种(品系) 过表达的P450 参考文献抗性家蝇(Rutgers) CYP6A1 Carino等，1992；1994。抗性家蝇(LeranPyrR) CYP6D1 Scott等，1996。 抗性果蝇 CYP6A2 Waters等,1992;Brun等,1996。 抗性果蝇 CYP6A9 Maitra等，1996。 抗性棉铃虫 CYPB2 Xiao-Ping和Hobbs, 1995。 吴峻等，1999。 抗性烟芽夜蛾 CYP4G8 Pittendrigh等, 1997。 CYP9A1 Rose等，1997。2. 抗药性机理及其分子根底.抗性昆虫中GST酶量的改动基因扩

11、增基因转录速率加快 尚未发现GST酶的质的改动2. 抗药性机理及其分子根底.靶标抗性 靶标敏感度降低是昆虫产生靶标抗性的第二种主要机理。普通来讲，杀虫剂进入昆虫体内经活化，或未被代谢的杀虫剂与靶标分子、靶标蛋白结合相互作用，改动其功能，结果产生中毒病症，最后死亡。由于抗性昆虫的靶标分子发生了变化，从而降低其与毒剂的结协作用，或降低与杀虫剂的作用，这种因敏感性降低而产生的抗性。称为靶标部位抗性(或靶标抗性)(target-site resistance)。 2. 抗药性机理及其分子根底.杀虫剂作用的主要靶标有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的作用靶标 乙酰胆碱酯酶(AChE)滴滴涕和拟除虫菊酯类杀虫剂的

12、作用靶标 钠离子通道环戊二烯类杀虫剂的作用靶标 -氨基丁酸(GABA)受体氯离子通道 2. 抗药性机理及其分子根底.靶标抗性的分子机理乙酰胆碱酯酶敏感度降低(Insensitive AChE)GABA受体突变(GABA receptor mutation)电压门控钠离子通道突变(mutations in the voltage-gated sodium channel)2. 抗药性机理及其分子根底. 品系 115 199 303 368 位置 Saltillo Ser Val Ala Tyr 突变 Bygdea Phe Val Ala Phe Pierrefeu Phe Thr Ala Phe

13、 MH19 Phe Ile Gly Tyr Sensitive Phe Ile Gly Phe果蝇AChE基因Ace中的抗性突变2. 抗药性机理及其分子根底乙酰胆碱酯酶敏感度降低. 家蝇抗性品系中发现的氨基酸点突变 抗性品系 突 变 位 点 49R G365A CH2 G262A F327Y 77M V180L G262A F327Y 690ab G262V F327Y CT V180L G262A F327Y YBOLV180L G262V F327Y SH-PR V180L G262V F327Y D422V2. 抗药性机理及其分子根底.抗性比抗性比果蝇单个和组合突变(以单字母氨基酸符号表

14、示)对AChE抗性的影响 2. 抗药性机理及其分子根底. AChE敏感度降低的埃及伊蚊Ace基因的定向突变 2. 抗药性机理及其分子根底.GABA受体突变(GABA receptor mutation) RDL GABA受体亚基的四个跨膜区黑色矩形和保守的半胱氨酸桥C=C，将每二个跨膜区M2放大可见抗性突变位点S 丙氨酸(Aly) 丝氨酸(Ser)2. 抗药性机理及其分子根底.电压门控钠离子通道突变 钠通道构造的方式图 (a)根据表25.6中所列文献；图(b)、(c)仿 Vais等 (2001)修正 a 表示多种昆虫与kdr抗性相关的突点位置图中编码是根据家蝇para序列(见GenBank X

15、96668)； b表示离子孔周围跨膜螺旋片段的方向； c 表示根据诱变和光亲和性标志实验所阐明的部分麻醉剂(local anesthetics, LA)、双鞭甲藻毒素 (brevetoxin, pbTx)和拟除虫菊酯(pyrethroids, Py)与S5和S6片段结合部位位置的放大表示图。 2. 抗药性机理及其分子根底.医昆kdr型抗性涉及的突变及其在Na+通道中的部位 构造域 kdr突变部位 虫种 文献构造域 S4-S5内环 I253V Dm Lee和Soderlund(2001) N端(S6-S1 接头)的S6处 D58G Bg Liu等(2000) 近S6处 E4334K Bg Liu

16、等(2000) 近S1处 C764R Bg Liu等(2000)构造域 S6 L1014F Md Williamson等(1996) S6 L1014F Hi Guerrero等(1997) S6 L1014F Ag Martinez-Torres等(1998) S6 L1014F Cp Martinez-Torres等(1999b) S6 L1014S Cp Martiney-Torres等(1999b) Ag Ranson等(2000) S6 L1029H Hv Park等(2000) S4-S5内环 M918T* Md Williamson等(1996) Hi Guerrero等(199

17、7) Pc Lee等(2000) S6 L993F Bg Dong等(1997); Liu等(2000)2. 抗药性机理及其分子根底.构造域 S6 M1524I Dm Lee和Soderlund(2001) S6 M1536I Dm Doyle等(1998) S6 F1550I Bm Pittendrigh等(1997); He等(1999) S5-S6 A1494V Dm Pittendrigh等(1997) S5-S6 V1410A Dm Pittendrigh等(1997)5端 构造域S6 5端 P1880I Bg Liu等(2000)Dm：黑腹果蝇(D. melanogaster) M

18、d： 家蝇(M. domestica) Cp： 尖音库蚊(C. pipiens) Ag：冈比亚按蚊(A. gambiae) Bg：德国小蠊(B. germanica)Hi：搔扰角蝇(H.irritans) Pc：头虱(P. capitis) Bm：微小牛蜱(B. microplus) *super-kdr突变 构造域 kdr突变部位 虫种 文献2. 抗药性机理及其分子根底.抗性早期诊断技术 在通常情况下，在田间防治失效时，抗性已是比较高了，只能换用无交互抗性的杀虫剂。抗性治理只需在抗性基因频率较低时才有效，所以必需对抗性种群进展抗性监测。 3. 抗性早期诊断技术.区分剂量discriminat

19、ing dosage技术 首先获得该虫种的SS个体，即敏感纯合子品系，对某种杀虫剂的敏感度基线(base-line data)，然后用该品系的LC99.9(或LD99.9)的剂量处置，存活的个体即为RS和RR个体。该方法的缺陷是：要经过遗传杂交的方法来纯化品系，较繁琐、费时；难以真正完全区分RS和RR个体；假设RS呈隐性，那么无法将SS和RS分开；无法了解其抗性机理。3. 抗性早期诊断技术. F1代与SS(曲线a)或与RR(曲线b)回交后的分别情况 “a 具有典型的1:1分别，“b没有明显的诊断剂量3. 抗性早期诊断技术.基于酯酶的测定方法(1) 运用高效液相层析(high-performan

20、ce liquid chromatography, HPLC)测定单个蚊虫的酯酶活性。酯酶水解模型底物-醋酸萘酯为醋酸和-萘酚，后者与染料固蓝盐B反响生成一种蓝紫色物质(=550600 nm)，用分光光度测定，以其光密度为酯酶活性。Pasteur和Georghiou1989根据这个原理，开展了测定单个昆虫的酯酶滤纸快速测定法。即取单个昆虫匀浆液磷酸缓冲液少许，点滴于滤纸上在此滤纸为携酶的载体，然后浸入含有-醋酸萘酯底物的磷酸缓冲液1 min后取出，再浸入含有显色剂的染色液，晾干后对色斑的大小和强度进展测定和比较。 3. 抗性早期诊断技术. 微量滴度酶标板法microtiter plate as

21、say测定了单个烟芽夜蛾幼虫的酯酶活性。测定底物为以对硝基苯乙酸(p-nitrophenyl acetate, PNPA)。酶液制备：取单个幼虫中肠，加500L匀浆缓冲液，用Polytron匀浆10 s。然后进一步匀浆(1000 g, 2 min)，上清液为酶源。酶源以1:150比例用0.1 mg/L磷酸钠缓冲液(pH 7.6)稀释，保温液含100 L稀释的酶液和0.5 mmol/L PNPA,最终容积为200 L。运用Thermomax微量滴度板酶标仪在30， 405 nm处进展检测。每15 s测定一次反响，总共测定15 min保温期。 用96孔酶标板为载体，依次在每孔穴中参与一定量的底物-

22、醋酸萘酯和单个昆虫的酶液，在室温保温30 min后，参与显色剂，置于便携式酶标仪下对96孔板读数microtiter plate assay。 上述的2种方法的优点是能快速、准确地测定与酯酶活性增高相关的抗性个体。缺陷是无法区分由酯酶性质改动而引起的抗性。 基于酯酶的测定方法(2)3. 抗性早期诊断技术.基于P450单加氧酶的(微量)滴度酶标板测定方法 运用对硝基茴香醚p-nitroanisole，PNA或甲氧基试卤灵methoxyresorufin，MRR作为P450加氧酶的底物。酶液制备用单个昆虫中肠在500 L匀浆液中匀浆10 s，然后离心1000 g, 2 min，上清液作为酶源。保温

23、液为75 L匀浆液，10 L NADPH再生系统0.25 mmol/L NADP+、2.5 mmol/L 葡萄糖-6-磷酸、1个单位葡糖-6-磷酸脱氧酶glucose 6-phosphate dehydrogenase，G6PD和15 mmol/L PNA，最终体积为200 L。然后用Thermomax微量滴度酶标板读数仪在30，405 nm测定 3. 抗性早期诊断技术.基于GST的快速测定法 GST活性生化测定比较复杂，而且要用分光光度计等仪器才干测定。最近Vontas等2000开展了一种简便的定量测定的GST活性的方法，也可用于单个昆虫的测定。在测定中运用GSH和CDNB在一个固定时间内获

24、得线性的酶反响后，在化学计量上运用碘(滴度)法iodometric titration测定游离的GSH，最后从不同的颜色范围获得测定结果。即用碘的滴度来测定GSH。用淀粉作为内指示剂，由于在淀粉溶液中碘化汞抑制GST活性，终止酶反响。 Brogdon和Barber(1990)运用微量滴度板测定了单个蚊虫的GST活性。 3. 抗性早期诊断技术.基于乙酰胆碱酯酶的测定方法 以模型底物乙酰硫代胆碱碘化物和5,5-二硫-双2-硝基苯酸进展Ellman反响(Ellman等，1961), 在存在少量AChE时产生黄色OD412。这种技术可用于检测不敏感的AChE。假设单个昆虫的样品一分为二，一个样品在反响

25、混合液中含有一个诊断浓度的杀虫剂；而另一个样品的反响液中仅含有底物无杀虫剂，根据有无产生黄色，那么可区分不同敏感性的变异体。 这种技术在几种昆虫中已作了测定，并运用动力学软件作了进一步改良，采用微量孔板读数系统microplate reader system进展自动检测，可检测单个昆虫的抗性基因型。斑点印迹dot-blot检测技术也已用于检测田间抗性个体的AChE 。 3. 抗性早期诊断技术.基于Kdr的电生理测定方法 运用电生理技术检测Kdr。通常运用昆虫的神经肌肉制备体来测定自发性微小兴奋性后突触电位miniature excitatory postsynaptic potentials，

26、mEPSPs和对不同浓度的拟除虫菊酯或滴滴涕杀虫剂反响引发的兴奋性后突触电位EPSPs。细胞内记录显示拟除虫菊酯诱发mEPSP活性添加，而EPSP值下降，而在抗性昆虫中要高浓度才干诱发。然后与敏感昆虫相比较，就能检测有无Kdr存在。3. 抗性早期诊断技术.基于PCR的抗性检测的诊断技术特异性等位基因的PCR扩增PCR amplification of specific alleles，PASA单链构象多态性分析single stranded conformational polymorphism, SSCPPCR限制性内切酶核苷酸(PCR restriction endonuclease nu

27、cleotide, PCR/REN)分析法 详见唐振华和毕强编著的，20033. 抗性早期诊断技术.抗性种群的演化4.出抗性治理战略. 影响抗性演化的主要因子 遗传学 生物学/生态学 操作 4.出抗性治理战略.遗传学1.抗性等位基因频率2. 抗性等位基因数目3.抗性等位基因的显性4.外显性(penetrance)、表达性(expressivity)、抗性等位基因的相互作用5.过去运用其它杀虫剂的选择作用6.抗性基因组与适宜度因子整协作用的程度，即抗性基因型和表现型在有或无杀虫剂时的适宜度(fitness)4.出抗性治理战略.生物学/生态学生物/生态学1.繁衍力，包括世代的长短和每代的虫数2.单

28、配性/多配性；孤雌生殖3.气候和其它生态条件行为1.隔离；挪动性；迁飞2.单食性/多食性3.幸存；庇护4.出抗性治理战略.操作因子化合物1.杀虫剂的化学性质2.用药历史3.杀虫剂的残效期4.剂型施药情况1.施药的限阈2.选择限阈3.施药时的虫期卵、幼虫或成虫4.限制防治空间5.施药方式6.用药次数4.出抗性治理战略.抗性治理的战略根据不同的详细情况分为3类：适度治理management by moderation饱和治理management by saturation复协作用治理management by multiple attack。 术语“适度和“饱和主要是指防治时所用药剂的剂量而言。“

29、复协作用这个术语用来表示长期或短期的多种作用的化学选择压。总之，所用的剂量应尽能够保管种群中的敏感基因。这3类措施并不是完全孤立的，在同一个防治方案中，这些措施可相互浸透。这完全取决于所处的实践情况。4.出抗性治理战略.抗性治理的化学防治战略适度治理饱和治理复协作用治理 低剂量，留一部分敏感基因型个体；减少杀虫剂运用次数；运用残效期短的药剂；防止运用缓释剂；定向选择成虫；部分而不是全面施药； 某一代或留下一部分种群不处置；坚持“庇护所；提高防治限阈运用高剂量，使R基因表达功能隐性；用增效剂抑制解毒机制药剂混用；药剂轮用；药剂镶嵌式交替防治 换用改动靶标的新药剂；杀虫剂的剂型工艺4.出抗性治理战

30、略.我组在该领域的研讨进展 建立抗性演化的模拟系统5. 研讨进展.抗性演化的模拟系统 5. 研讨进展.抗性由同一基因座上的两个等位基因R和S控制的抗性害虫种群在一 种杀虫剂作用下，种群个体的基因型可分成RR、RS和SS三种方式。根据群体遗传学原理，在平衡种群中，三种基因型个体各自所占的比例分别为p2、2pq和q2。因此，Nt+1=Nt+1RR+Nt+1RS+Nt+1SS=(1-qc)db+(1-bn)W1pt2Nt(1-de)(1-de)+df2MiexprRR(1-Mtp/K)+2(1-qc)hbn+(1-bn)W2ptqtNt(1-dc)+2hf(1-f)MiexprRS(1-Mt/K)+(1-qc)b+(1-b)W3qt2Nt(1-de)(1-dc)+(1-f)2Miexprss(1-Mt/K)Mi=W1Pt2+2W2ptqt+W3qt2(1-bn)+(dpt2+2hptqt+qt2)bnNt(1-de)(1-de)qtNa=(W1pt2+2W2ptqt+W3qt2)(1-bn) +(dpt2+2hptqt+W3qt2)bn(1-dc)(1-de)qcMt=(W1pt2+2W2ptqt+W3qt2)(1-bn)+dpt2 +2hptqt+qt2)bNt(1-dc)(1-dc)-Na +M