家禽新城疫HAHI的免疫监测(共10页)

1、实 验 二 家禽具血凝性病毒(bngd)病的免疫监测一、实验(shyn)目的1.掌握血凝性病毒(bngd)病免疫监测的基本方法。2.学会根据血凝性病毒病免疫监测的结果指导鸡群血凝性病毒病免疫接种。二、实验内容 1.红细胞凝集试验检测抗原的HA效价及4个血凝单位抗原的配制。2.红细胞凝集抑制试验检测免疫禽只的HI抗体。3.根据血凝性病毒病免疫监测的结果指导鸡群相应病毒病的免疫接种。三、实验仪器、设备及材料1.抗原原液：购自标准厂家，根据监测抗体的种类而确定抗原的种类。ND免疫监测ND抗原；AI H5免疫监测H5抗原；AI H9免疫监测H9抗原；EDS76免疫监测EDS抗原。2.被检血清：随机采取

2、被检禽群的血液（抽样比例约为12，或每个禽群抽取2040只），取血液自然凝固后析出的血清作为被检血清。3.灭菌PBS生理盐水，PH7.0，按常规配制。4.红细胞悬浮液：采取健康公禽（被检测血清为鸡血清时，应采用公鸡，被检血清为鸭、鹅血清时，应采用公鸭）血液（每次可采510mL），抗凝，加灭菌PBS生理盐水离心洗涤35次（每次离心的速度和时间为3000转/分钟，15分钟，将血浆、白细胞等充分洗去，将沉淀的红细胞用灭菌PBS生理盐水稀释成1悬浮液。该红细胞悬浮液在4存放，可用35天。注意悬浮液颜色变暗应予弃去。5.其他材料：25uL移液器，96孔V型反应板，普通离心机等。（以下内容主要以ND的免疫

3、监测为例，同学们可依此类推探讨其他血凝性病毒病免疫监测的相关技术）四、实验原理鸡群ND免疫后，体内可产生抗ND中和抗体及红细胞凝集抑制抗体（HI抗体）。后者在体外可抑制NDV凝集红细胞的能力。在一系列试管中，将被检鸡血清作连续稀释，血清中HI抗体越高，则能使ND病毒凝集红细胞能力完全抑制的血清稀释度就越高。由于HI抗体与中和抗体的消长是基本一致的，故通过HI抗体水平的检测可以达到ND免疫监测的目的。五、实验步骤(一) 红细胞凝集试验（微量法检测ND抗原原液HA效价及配制4个血凝单位ND抗原）1.分装生理盐水：用移液器在96孔V型反应板的一排孔上的112孔，每孔加入PBS生理盐水25uL，换滴头

4、；2.添加抗原：吸取标准ND抗原原液25uL加入第1孔，换滴头；3.稀释抗原：用25uL移液器将第1孔中的抗原与PBS生理盐水吹打2-3次混合均匀并吸取25uL至第2孔；用移液器将第2孔中的抗原与PBS生理盐水吹打2-3次混合均匀并吸取25uL至第3孔，如此，直至第11孔，从11孔吸取25uL溶液弃去，换滴头；4.加入PBS生理盐水：向1-12孔加入PBS生理盐水，每孔25uL；5.加入红细胞悬浮液：向1-12孔加入红细胞悬浮液，每孔25uL；6.静置感作20-30分钟，然后判定结果；7.判定结果（观察、判定、记录反应结果的相关概念与方法）“凝集(nngj)”的概念：观察反应孔，当一层红细胞凝

5、集(nngj)颗粒均匀覆盖于整个孔底，判定为“凝集(nngj)”（将反应板倾斜，无红细胞流淌现象），记录为“+”。 “不凝集”的概念：观察反应孔，当红细胞完全自然沉降到孔底中央，形成一个边缘光滑无凝集颗粒的红圆点，判定为“不凝集”（将反应板倾斜，有红细胞流淌现象），记录为“”。ND抗原的血凝效价的概念：凡能使鸡红细胞完全凝集的抗原最高稀释度称为该ND抗原的血凝效价。判定、记录反应结果的方法判定、记录反应结果时，可绘制一个表格，将试验情况与结果判断作填写。如下是一个ND抗原原血凝效价测定结果判定与记录的例子，可作模仿。孔号123456789101112效价抗原稀析1：24816326412825

6、651210242048PBS对照1：64反应图像结果记录+-84个血凝单位（4HAU）抗原的配制方法依据ND抗原原液的HA效价，用PBS生理盐水将该抗原原液稀析为4HAU抗原（用于下述HI试验）。每mL抗原原液加入PBS生理盐水的毫升数为：该抗原原液效价的倒数除以4减1。如上例，抗原原液效价为1：64，则，每mL抗原原液加入PBS生理盐水的毫升数为64/4-1=15。（二）红细胞凝集抑制试验（微量法）检测免疫禽只的HI抗体。1分装PBS生理盐水：在96孔反应板上，取其12孔，第1-11孔每孔加入PBS生理盐水25uL;2.向第1孔加入被检血清；3.稀释被检血清: 用25uL移液器将第1孔中的

7、被检血清与PBS生理盐水吹打2-3次混合均匀并吸取25uL至第2孔；用移液器将第2孔中的抗原与PBS生理盐水吹打2-3次混合均匀并吸取25uL至第3孔，如此，直至第10孔，从10孔吸取25uL溶液弃去，换滴头；4.加入4HAU抗原：向第1至第11孔加入4HAU ND抗原溶液，每孔25uL;5加入红细胞悬液：向第1至第12孔加入1鸡红细胞悬浮液，每孔25uL，室温中静置2030分钟，观察结果并记录。6. 判定结果（观察、判定、记录反应结果的相关概念与方法）“凝集”的概念：观察反应孔，当一层红细胞凝集颗粒均匀覆盖于整个孔底，判定为“凝集”（将反应板倾斜，无红细胞流淌现象），记录为“+”，读作凝集。

8、“完全抑制”的概念：观察反应孔，当红细胞完全不凝集而自然沉降于试管底部中央，形成一个边缘光滑的红圆点，边缘没有分布红细胞凝集颗粒，判定为完全抑制，记录为“”，读作完全抑制；被检血清HI效价的概念：凡能使0.25mL 浓度4个凝集单位的ND抗原凝集红细胞的能力完全抑制的血清最高稀释度称为该被检血清的HI效价。判定、记录反应结果的方法判定、记录(jl)反应结果时，可绘制一个表格，将试验情况与结果判断作填写。如下是2个被检血清HA效价测定结果判定与记录(jl)的例子，可作模仿。孔号123456789101112效价血清稀析 度1：2481632641282565121024抗原对照PBS对照1：25

9、6血清1反应图像结果记录-+-血清2反应图像1：64结果记录-+-（三）根据ND等血凝性病毒(bngd)病免监结果指导鸡群相应病毒病免疫接种的步骤1计算禽群ND抗体合格率禽群ND抗体合格率的计算公式：ND抗体合格率=（被检血清样品数-抗体效价低于临界滴度*的样品数）/被检血清样品数100%。*注：ND抗体效价临界滴度：鸡群可抵抗NDV感染的ND抗体的最低滴度。这是一个由生产实际总结得出的数值，可因实际情况的变化而变化。目前，此值通常定为1：32。2.确定禽群抗体合格率的标准 禽群抗体合格率的标准也是一个由生产实际总结得出的数值，而且鸡的日龄不同其标准有不同。目前各种日龄鸡群能够抵抗ND感染的的

10、抗体合格率参考标准为：1月龄以下的小鸡，抗体合格率要求在85以上，且其余15的被检鸡只的抗体水平不低于1:5；中成鸡群的抗体合格率应在95以上，且其余5的被检鸡只的抗体水平应不低于1:5。3将被检鸡群抗体合格率对照禽群抗体合格率的标准，确定被检鸡群目前的免疫状况，指导其进一步的免疫接种。 如下为根据ND等血凝性病毒病免监结果指导鸡群相应病毒病免疫接种的一个例子：某后备种鸡群，18周龄，共3000只种鸡，随机采血20份，经ND HI试验检测，各样品抗体水平情况如下表。请根据该免监结果，对该指导鸡群的ND免疫接种作指导。抗体效价1:640监测只数13316600解：1计算鸡群ND抗体合格率（临界滴

11、度取1：32）：鸡群ND抗体(kngt)合格率（被检血清样品数-抗体(kngt)效价低于临界滴度*的样品(yngpn)数）/被检血清样品数100%（20-4）/20100%80% 2. 确定禽群抗体合格率的标准：本鸡群为中成鸡群，中成鸡群的抗体合格率标准为95以上，且其余5的被检鸡只的抗体水平应不低于1:5。3. 将被检鸡群抗体合格率对照禽群抗体合格率标准，确定被检鸡群目前的免疫状况： 该被检鸡群的ND抗体合格率为80%，而中成鸡群的抗体合格率标准是95%，故可见该鸡群目前ND免疫状况未及格，建议尽快给于ND疫苗的加强免疫接种。六、实验报告要求1.扼要反映本实验步骤。2.报告实验结果应包括各被

12、检血清样品各孔的反应结果和各被检血清的HI效价，及应用本试验结果指导被检鸡群的ND临床免疫接种。3.试指出应用本技术对不同的血凝性病毒病作免疫监测时，在材料、方法上有何异同。七、实验的注意事项 (参阅实验步骤)八、思考题家禽具血凝性病毒病的免疫监测技术有哪些关键点?请作扼要陈述。实验二 家禽具有血凝性病毒病的免疫监测（以ND为例，兼顾各种病免疫监测技术的特点）一、实验目的 1.掌握ND等家禽血凝性病毒病免疫监测的基本方法。 2.学会根据ND免疫检测的结果指导禽群的ND等血凝性病毒病免疫接种。二、实验内容 1.红细胞凝集试验检测抗原的HA效价。 2.红细胞凝集抑制试验检测免疫禽只的HI抗体。三、

13、实验仪器、设备及材料 1.抗原：购自标准厂家，根据监测抗体的种类而确定抗原的种类。ND免疫监测ND抗原；鸽瘟（禽PMV-）免疫监测PMV-抗原；AI H5免疫监测H5抗原；AI H9免疫监测H9抗原；EDS76免疫监测EDS抗原。 2.被检血清：随机采取被检禽群的血液（抽样比例约为12，或每禽群抽取2040只），取其自然析出的血清作为被检血清。3. 1红细胞悬浮液：采取健康公禽血液（每次可采510mL），采血后抗凝，加生理盐水离心洗涤35次（每次离心的速度和时间为3000转/分钟，15分钟，将血浆、白细胞等充分洗去），将沉淀的红细胞用生理盐水稀释成1悬浮液，这种红细胞液在4存放，可用35天。注

14、意悬浮液颜色变暗应予弃去。红细胞来源(liyun)，检测鸡血清鸡红细胞，检测(jin c)鸭、鹅血清鸭红细胞。 4.灭菌(mi jn)生理盐水：pH7.07.2。 5.移液器（规格分别为0.1mL、0.4mL、0.5mL、1mL），20孔反应板（每孔的体积为1mL），10mL注射器、玻璃铅笔、剪刀、镊子等。四、实验原理 鸡群经ND免疫后，体内可产生抗ND中和抗体及红细胞凝集抑制抗体（HI抗体）。后者在体外可抑制NDV凝集红细胞的能力。在一系列试管中，将被检鸡血清作连续稀释，血清中HI抗体越高，则能使ND病毒凝集红细胞能力完全抑制的血清稀释度就越高。由于HI抗体与中和抗体的消长是基本一致的，故通

15、过HI抗体水平的检测可以达到ND免疫监测的目的。五、实验步骤 1.全量法测定抗原原液的血凝效价（红细胞凝集试验，HA试验） 1.1操作方法 在20孔反应板上，取其10孔，第1孔加入灭菌生理盐水0.9mL，第210孔各加入0.5mL。用0.1mL移液器吸取ND抗原原液0.1mL加入第1孔中，用0.5mL移液器将第1孔内抗原与生理盐水充分吹打均匀，吸取0.5mL至第2孔，吹打均匀，再吸取0.5mL至第3孔如此依次倍倍稀释，至第9孔，由第9孔吸出0.5mL弃去。第10孔不加抗原，只加生理盐水作对照。这样，各孔ND抗原原液的稀释度依次为110，120，14012560。然后向各孔加入1红细胞悬浮液0.

16、5mL，静置2030分钟，于第1015分钟开始观察，一直观察到30分钟，判定并记录抗原原液的HA效价。具体术式见表31。 1.2结果判定与记录方法 1.2.1判定结果的方法：当一层红细胞凝集颗粒均匀覆盖于整个孔底，判定为“完全凝集”，记录为“#”。当一层红细胞凝集颗粒均匀覆盖于孔底3/4面积时，称不完全凝集，记录为“+”；依次类推为“+”、“+”，均为不完全凝集，这时孔底中央会形成一个小红圆点，是未凝集的红细胞自然沉降集中于孔底中央。当红细胞完全自然沉降到孔底中央，形成一个边缘光滑无凝集颗粒的红圆点，判定为完全不凝集，记录为“”。结果判定与记录如表31。1.2.2判定ND抗原的血凝效价：凡能使

17、红细胞完全凝集的抗原最高稀释度称为该ND抗原的血凝效价，如表31，其ND抗原的血凝集效价为1640。其含义是该ND抗原原液作640倍稀释，每0.5mL有一个血凝单位，即每0.5mL抗原原液含有640个血凝单位的抗原。表21 红细胞凝集试验术式与结果（单位：mL）孔号12345678910抗原稀释倍数1020408016032064012802560对照生理盐水0.90.50.50.50.50.50.50.50.5ND抗原液0105050505050505弃1红细胞0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5感作温度及时间2030 1015分钟结果举例试管底图象记录#+- 2.全

18、量法测定血清抗体水平（红细胞凝集(nngj)抑制试验，HI试验）操作方法 2.1分装生理盐水：在20孔反应(fnyng)板上，取其10孔，第1孔加入灭菌生理盐水0.4mL，第29孔加0.25mL，第10孔加0.5mL。 2.2加入(jir)被检血清并稀释：用0.1mL移液器，吸取0.1mL被检血清加入第1孔，换取0.25mL移液器吹打使之充分混合，从中吸取0.25mL加入第2孔，吹打之充分混合，从中吸取0.25mL至第3孔如此一直稀释至第8孔，从第8孔中吸出0.25mL弃去，第9、10号孔不含血清。 2.3加4单位抗原：向第1至第9孔加入4个血凝单位ND抗原溶液【经上述HA试验测定血凝效价的抗

19、原原液，根据其血凝效价用生理盐水稀释为4个血凝单位，稀释方法为每1mL抗原原液，加入生理盐水（加入生理盐水体积（mL）抗原原液中的血凝单位数/41），为提高试验的准确性，可进行4个血凝单位抗原的滴定，即将假定为4个血凝单位的抗原，分别取其原液、1:2、1:4、1：8倍稀释液各0.5mL，各加入0.5mL 1%的红细胞后，观察其凝集的情况，若在1:4倍稀释孔中出现非完全凝集的情况，表明4个单位的抗原浓度偏低；若在1:8倍稀释孔中出现“”以上的凝集的情况，表明抗原的浓度偏高。并根据以上结果作相应的调整】，每孔0.25mL，第10孔不含抗原作空白对照。 2.4添加红细胞悬液：向第1至第10孔加入1鸡

20、红细胞悬浮液，每孔0.5mL，轻轻振荡，室温中静置1030分钟，观察结果并记录。具体方法见表32。 2.5结果判定与记录方法 2.5.1判定结果的方法 当红细胞完全不凝集而自然沉降于试管底部中央，形成一个边缘光滑的红圆点，边缘没有分布红细胞凝集颗粒，判定为完全抑制，记录为“”，当试管底红圆点周围分布少量红细胞凝集颗粒时，判定为不完全抑制，记录为“+”，随着红圆点的逐渐缩小，红细胞凝集颗粒分布的逐步增多，而可依次记录为“+”，“+”和“#”。结果判定与记录举例见表32。 2.5.2确定被检血清的红细胞凝集抑制抗体效价（HI效价）在本HI试验术式中，凡能使0.25mL 浓度4个凝集单位的ND抗原凝

21、集红细胞的能力完全抑制的血清最高稀释度称为该被检血清的HI效价。如表32结果举例，该血清HI效价为180。表22 红细胞凝集抑制试验术式与结果举例（单位：mL）材料孔号12345678对照对照稀释度1:51:101:201:401:801:1601:3201:640生理盐水0.40.250.250.250.250.250.250.250.250.5血清0.10.250.250.250.250.250.250.25弃4单位抗原0.250.250.250.250.250.250.250.250.251鸡红细胞悬液0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5感作1520分钟后，每5分

22、钟观察一次，直到60分钟结果举例试管底图象记录+#3. 根据免疫监测(jin c)的结果指导鸡群的免疫接种统计所有被检血清样品（20或40份样品）的HI效价，根据抗体的临界滴度（能够使鸡群免受ND感染(gnrn)的ND HI抗体的最低滴度，通常为120）计算(j sun)鸡群HI效价的合格率（其公式为：鸡群抗体合格率被检鸡只数抗体滴定低于临界滴定的鸡只数）/被检鸡只数100。并对照各种日龄鸡群能够抵抗ND感染的的抗体合格率参考标准，即：1月龄以下的小鸡，抗体合格率要求在85以上，且其余15的被检鸡只的抗体水平不低于1:5；中成鸡群的抗体合格率应在95以上，且其余5的被检鸡只的抗体水平应不低于1

23、:5，则说明鸡群抗体水平能够抵抗ND强毒感染，暂时不需要加强ND的免疫接种。）4.微量血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验技术4.1材料准备4.1.1 96孔V型微量反应板，微量移液器（配滴头）。 4.1.2 pH7.2的0.01M磷酸盐缓冲盐水（PBS）（配方一：磷酸氢二钠1.10g，二水磷酸二氢钠0.316g，氯化钠8.50g，加水1000mL，用氢氧化钠或盐酸调pH至7.2，高压灭菌备用；配方二：磷酸氢二钠1.15g，磷酸二氢钾0.20g，氯化钾0.20g，氯化钠8.00g，加水1000mL，高压灭菌备用）4.1.3 阿氏（Alsevers）液配制:葡萄糖 2.05g，柠檬酸钠 0.8g，

24、柠檬酸 0.055g，氯化钠 0.42g，加蒸馏水至100mL，加热溶解后调pH值至6.1，69kPa 15min高压灭菌，4保存备用。4.1.4 1%红细胞悬液制备：采集至少3只SPF公禽或无禽流感和新城疫等抗体的健康公禽的血液与等体积阿氏液混合，用pH7.2的0.01mol/L PBS液洗涤3次，每次均以1000r/min离心10min，洗涤后用PBS配成1%（V/V）红细胞悬液，4保存备用。4.1.5血凝性病毒病抗原和标准血清以及阴性血清。4.2操作方法4.2.1 血凝（HA）试验（微量法）4.2.1.1在微量反应板的1-12孔均加入0.025mL PBS，换滴头。4.2.1.2吸取0.

25、025mL抗原加入第l孔，混匀。4.2.1.3从第1孔吸取0.025mL抗原PBS混合液加入第2孔，混匀后吸取0.025mL加入第3孔，如此进行对倍稀释至第11孔，从第11孔吸取0.025mL弃之，换滴头。4.2.1.4每孔再加入0.025mL PBS。4.2.1.5每孔均加入0.025mL 1%（V/V）鸡红细胞悬液（加入前，应将鸡红细胞悬液充分摇匀）。4.2.1.6振荡混匀，在室温（20-25）下静置40min后观察结果（如果环境温度太高，可置4环境下1hr）。对照孔红细胞将成明显的圆点状沉到孔底。4.2.1.7结果判定。将反应板倾斜，观察红细胞有无呈泪滴状流淌。完全血凝（不流淌）的抗原或

26、病毒最高稀释倍数代表一个血凝单位（HAU）。表2-3 HA试验微量法操作术式252525252525252525252525ND抗原液#25252542#25252521+#记录图象结果举例2030C 1015分钟感作温度及时间252525252525252525251%红细胞25252525252525252525PBS25252525252525252525PBS对照204810245122561286432168抗原稀释倍数1211109876543孔号4.2.2 血凝抑制（HI）试验(shyn)（微量法） 4.2.2.1根据血凝试验结果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀释倍

27、数作为终点，终点稀释倍数除以4即为含4HAU的抗原的稀释倍数。例如，如果血凝的终点滴度为1:256，则4HAU抗原的稀释倍数应是1:64（256除以4）。4.2.2.2在微量反应(fnyng)板的1-11孔加入0.025mL PBS，第12孔加入0.05mL PBS。4.2.2.3吸取0.025mL血清加入(jir)第1孔内，充分混匀后吸取0.025mL置于第2孔，依次对倍稀释至第10孔，从第10孔吸取0.025mL弃去。4.2.2.4 1-11孔均加入含4HAU混匀的病毒抗原液0.025mL，室温（约20）静置至少30min。4.2.2.5每孔加入0.025mL的鸡红细胞悬液轻轻混匀，静置约

28、40min（室温约20，若环境温度太高可置4条件下1hr），对照红细胞将呈显圆点状沉于孔底。表2-4 HA试验微量法操作术式4.3结果(ji gu)判定在对照孔出现正确结果的情况下，以完全抑制(yzh)红细胞凝集的最大稀释度为该血清的血凝抑制滴度。免疫鸡群血清抑制滴度在4log2的鸡群保护率为50左右；在4log2以上的保护率达90100；在4log2以下的非免疫鸡群保护率约为9，免疫过的鸡群约为43。鸡群的血凝抑制滴度以抽检样品的血凝抑制滴度的几何均值表示，如平均水平在4log2以上，表示该鸡群为免疫鸡群。六、实验报告要求(yoqi) 1.扼要反映本实验步骤。2.报告实验结果应包括各孔的反应

29、结果和被检血清的HI效价。3.叙述影响试验结果的因素和注意事项。 4.说明应用本试验结果指导ND临床免疫的方法。七、影响免疫监测的因素及注意事项 1.病毒（抗原） 1.1病毒抗原应避免反复冻融和污染； 1.2在凝集抑制试验中，不足量的抗原，有可能被大多数血清非特异性抑制之倾向，即假阳性。因此，有必要用足量的抗原避免误差。但过量的抗原也会大大降低试验的敏感度，在配制4单位抗原时，一定要准确。 2.红细胞 2.1来自不同公禽个体的红细胞，对抗原的敏感性存在着差异。配备红细胞时，如需用来自几只公禽的血液则应将之混合进行洗涤配制。采血禽只若注射过相应疫苗时，则需彻底洗涤5次以上。另外，成年公禽是最好的

30、红细胞供体。 2.2为使1红细胞的悬液的浓度准确，在红细胞洗涤过程，最后一次离心必须统一用3000转/分钟，离心10分钟，并充分吸干上清液，然后将沉淀的红细胞按1的比例进行稀释。 2.3保存红细胞的阿氏液，内含柠檬酸钠葡萄糖，因此易于生长细菌，而污染杂菌的红细胞悬液易发生溶血和自凝。如果保存于阿氏（Alserer）液中红细胞，一旦发生变色或溶血就不能再用。无污染情况下，使用阿氏液保存的红细胞的时间最长不宜超过1周。 2.4红细胞浓度的标准化：为使在试验中红细胞浓度一致，常用的方法是：a.灯光比色计；b.用细胞计数板数血球；c.最方便的方法是最后一次离心的速度和时间恒定,使红细胞泥压实后的密度基本一致。 3.血清 3.1非特异性抑制现象：血清常含有对病毒凝血素作用的非异性抑制物质，这些物质为粘液素类脂蛋白或类脂质等。血清中抑制因子结构性质与红细胞表面（类粘液蛋白）相似，因而夺去病毒与红细胞结合的机会，为了消除这些抑制，可采用白陶土处理法，即将血清5630分钟灭活后，以生理盐水作15稀释，再加等量25白陶土混合均匀