LS50荧光分光光度计操作手册

1、LS-45/55荧光/磷光/发光分光光度计使用说明书美国PerkinElmer公司王国强黄建权编译2002年4月、理论基础荧光、磷光、化学发光及生物发光均属于分子发光。现将其原理简介如下：室温下，大多数分子处于基态的最低振动能层。处于基态的分子吸收能量后被激发为激发态。激发态不稳定，将很快衰变到基态。若返回到基态时伴随着光子的辐射，这种现象被称为“发光”。每个分子具有一系列严格分立的能级，称为电子能级，而每个电子能级中又包含了一系列的振动能层和转动能层。图中基态用S表示，第一电子激发单重态和第二电子激发单重0态分别用SS表示，0、1、2、3表示基态和激发态的振动能层（见图1）,第一、1、2二电

2、子的激发三重态分别用T和T表示（见图2）。12图1荧光的能级图VibrationalLevelsofsecondexcitedtateVibrationalLevelsoffirstexcitedstateInternalCcnversianFluofescence(109-W12*6sec)VibrationalLevelsofgroundstateRotationallevelsSfngletsystemso3、化学发光及生物发光的产生某些物质在进行化学反应时，由于吸收了反应时产生的化学能，而使反应产物分子激发至激发态，受激分子由激发态回到基态时，便发出了一定波长的光，这种吸收化学能使分子

3、发光的过程称为化学发光。化学发光也发生于生命体系，这种发光被称为生物发光。仪器简介仪器原理Samp：e检测墨连绩光谱连銭英光光谱发射单色器草一死谱用于测量荧光/磷光/发光的LS45/55是由图3所示的五个主要部件组成的：光源、激发光单色器、样品池、发光单色器及检测器。由光源发出的光经激发光单色器得到所需要的激发光波长。如其强度为I,通过样品0池后，由于一部分光能被荧光物质吸收，其透射光强度减为I。荧光物质被激发后，将发t射荧光。为了消除入射光和散射光的影响，荧光的测量通常在与激发光成直角的方向进行。为了消除可能共存的其他光纤的干扰，如由激发光所产生的反射光、瑞利散射光和拉曼光，以及为将溶液中的

4、杂质所发生的荧光滤去，以获得所需要的荧光，在样品池和检测器之间设置了发光单色器，荧光作用于检测器上，得到了相应的电信号，经放大后再记录下来。(1)激发光源：在紫外一可见区范围内，氙灯最为常用，而又分连续和脉冲氙灯。LS45/55采用的是脉冲氙灯。二者比较如下:脉冲氤灯与连续氤灯的比较总对耗迖奄源锲应复蘿柱连续亂灯声生曼氧很另他型倒逾遽一辽生热量犧一一二ZZT麺展时阔预热，不測垃感亘爰囲萃當峥启动陳冲T20S申仅宥10W的强光照蔚，丸丸减少光W_._.*匸*脉冲丽测定暗遇流.増进極熒光一h矿T禺隸韩控制即可测楚磷竝还蛊鯉不憨脉冲率延迟以阉及脉冲氙灯的LS4_需m池脉冲氙灯的样当于4需5用低(5的

5、工作雜升驗0迴竺.肩;长硏同预臥飞达45世“陋鑽有咅压启动脉沖丽戡礙住丽生光帥用丽亦或切勰翩定SOTO越光附待才能側定礙蘇雨匱用时杵而有损失，雜迟时阖込附杵转速隈制-直&接测址而光衩f5光及_为宜。（3）激发单色器：用于选择激发波长。（4）发射单色器：用于分离出荧光/磷光/发光的发射波长。（5）检测器：荧光的强度通常比较弱，因此应采用具有较高灵敏度的光电倍增管，并与激发光成直角。LS45/LS55的标准检测器检测下限为650nm,若要测到90Onm则应选择红敏倍增管。三、软件应用（一）、仪器状态菜单的应用图4仪器状态（Status）菜单在仪器状态（Status）菜单（见图4）中的应用（Appl

6、ication）项下的下拉菜单中的LS-55Status中点击，则出现图5的菜单。图5仪器状态菜单此菜单中的各部分，均为动态对话框。点击其中任何部分均可进入下一级菜单，通过参数上的设置，直接用软件控制仪器。如点击左上角的光源部分（Source）,随即出现图6的菜单：可实现光源的开关、及荧光、磷光和发光测定模式的选择。1、荧光测定模式的设置图6荧光测定模式的设定在红色的“LuminescenceMode”中“fluor（荧光）”，即可选定荧光测定模式。通过点击右上角的红色数字“1（氙灯开）”或“0（氙灯关）”，即可控制光源的开关。2、磷光测定的设置在红色的“LuminescenceMode”中“

7、phos（磷光）”，即可选定荧光测定模式（图7）图7在磷光测定模式下样品受脉冲氙灯光源激发后的测定条件。氙灯每闪亮一次所产生的能带峰其带宽不超过1Ous。在此期间，受激样品所产生的磷光达到最大强度值I,0然后按指数曲线衰减直至消失。样品光电倍管要等延迟一段时间（t）后才开启，所以不d会与光源的闪亮时间重合，门限时间（tg）测量时间与延迟时间（t）均可调节，最小调整步距为0.01ms如选择的延迟时间大于0.1ms，就不会测量到荧光信号。每个测定周期可以大于一次闪亮。例如：设闪亮次数为3,则在每一个测定周期中有3次闪亮及其后的延迟时间和门开时间。所设的周期时间（CycleTime）应三（闪亮数X电

8、源频率周期）+tg+t-12.99ms。如tg+t值大于12.99ms，周期时间应设至大于一个电源周期。闪亮频gdgd率及电源的周波（在中国为50Hz）,所以每次闪亮即电源的一个周期（在中国为20ms）。在磷光的测定模式中，暗电流是在开始测定后自动在20个数据收集周期中进行测定的，暗电流信号被储存并在该设定波长下测定的样品信号中被减去。每当改变门限时间时，自动重新测定暗电流。各参数范围如下表：参数范围步距延迟时间(DelayTime,t)09000ms0.01ms门限时间(GateTime,t)0.01500ms0.01ms周期时间(CycleTime)19999ms一个电源周期（ms）闪亮次

9、数（Flash）1101注：周期时间（CycleTime）应三（闪亮数X电源频率周期）+tg+td-12.99ms。如tg+td值大于12.99ms，则周期时间应设至大于一个电源周期。3、发光（化学、生物）发光测定的设置在红色的“LuminescenceMode”中“biolum（发光）”，即可选定发光测定模式（图8）。图8发光测定模式的设定当测定化学或生物发光时，应将光源灯关闭，只有样品光电倍增管接受数据信号，积分时间与磷光测定时一致。暗电流则自动测定20次（每隔20ms测一次），数据储存并自动从样品测定数据中减去。每当门限时间改变后，都会自动重测暗电流。（二）扫描（Scan）菜单的应用1、

10、扫描的三种方式1.1预扫描：以便找出未知样品的最适宜激发波长；12单个单色器扫描：可单独进行激发光或发射光的光谱扫描；1.3同步扫描：两个单色器以一定的波长间距同步转动进行扫描；2、预扫描2.1激发光单色器预扫描（发射光单色器固定在某波长）2.2发射光单色器预扫描（激发光单色器固定在某波长）2.3激发/发射预扫描（自动顺序进行上述两种预扫描）图9激发/发射预扫描菜单在相应的对话小框中分别键入激发光和发射光的起止波长。在狭缝小框中分别键入激发光和发射光的宽度。3、激发或发射光谱的扫描3.1激发光谱的扫描3.2发射谱的扫描点击图中Ex.Momo或Em.Mono的单色器图标，则可得到下图：图13激发

11、或发射单色器的设置菜单点击图13中的“EmissionFilter”中下拉箭头，即可出现一下拉菜单，可选择在光路中加入一定波长下的截止滤光片以消除倍频峰，还可选择“1%Attenuator”即1%的透过衰减片，以降低过强的荧光强度。4、同步扫描同步扫描有助于一些有机化合物的判别，特别是复杂的混合物物，如粗油。同步扫描又分为“固定波长差”或“固定能量差”这两种形式。SetupParametersSynchronousWavelengthScan辭Scan:C:FLWINLABMETHODSscanmthFileInstrurneritHedp:SetupparametersUserinfoVie

12、wresultsExcitationEmiion|Synchronous$入Synchronous6EPje-ScanScanRangeParametersStart(nm):370End(nm):阿D|DeltaLambda(nm)=弓|ScanSpeed(nm/min):500ExSlit(nmjpO.O|EmSlit(nm):卩0一。j4、时间驱动模式时间驱动模式可供在固定波长上记录一定时间内的样品荧光强度变化。图14的菜单中“Durations（s）”为所要测定的总时间（秒），“DataInterval（s）”为每两个测量点间的时间（秒）。5、强度/浓度模式（Read）自动测浓度的步骤

13、：5.1将所含已知浓度的样品标准溶液放入样品室；5.2确认所需的波长及狭缝均已设好；5.3选定Autococn行，并在下面的小框中键入该标准溶液的浓度值；5.4键入所需的信号积分时间；5.5单击Intensity,标准溶液的荧光强度值会显示在其右边的小框中，此值自动被刚输入的浓度值所除，得到其商K并暂存，只要一直选定Autococn行，以后的样品测定所得的荧光强度会自动乘上K值而成为浓度值显示。6、波长编程扫描模式(WavelengthProgram)图16波长编程扫描模式(WavelengthProgram)菜单波长编程扫描可在一系列不同的激发和发射波长下来测定样品的荧光强度。7、用标准曲线

14、法测定浓度的模式ApplicationMenuFileViewUtilitiesDatahandlingWindowHelp辭FLWinLabApplication園RmltWinci回回函|壓D師Region回回罔颅Graphl回回囲图17仪器应用选项菜单在图17中选择“Concentration（浓度）”项，即可出现下图:设定激发波长、最大发射波长及激发与发射狭缝等条件后，点击“Refrence”项，即可出现下图：ReferencesUserinfoMeasurestdlanewInsert|Add|RemoveFilldownclearRef.IDFactorCone.Int.BG.st

15、dla1.0010.GC8.0000.000stdlb1.010ao20.0000.000Tstd2a1.050.0052.0000.000std2b1Eid50.0055.0000.000std3a1.0100.0098.0B00.000std3b1.0100.00120EjDC0.000std4a1Eid500.00501.0.000std4b1.0500.00G000.000Concentrationunits光强度I下图:Cone,limitswarningx-10.00ViewresultsSampleIDFactorInformationIntensityBGCone.Sampleli.oeunder-range1.0G00000O.l；23Sample2i.ob戚1000D鈕2.442Sample3i.obover-range20.00(000017.902在图20中输入相应的数据后，点击“ViewResuIts项，即可得到下图:图21浓度测定模式待测样品结果图21显示了待测样品的浓度。1、荧光的产生当分子处于单