临床基因扩增检验的质量保证(新-临床聚合酶链反应测定的质ppt课件

1、临床基因扩增检验的质量保证卫生部临床检验中心 李金明.定 义质量保证(Quality Assurance,QA) 为一产品或效力满足特定质量要求提供充分可信性所必要的有方案的和系统的措施。 室内质量控制Internal Quality Control,IQC) 由实验室任务人员，采取一定的方法和步骤，延续评价本实验室任务的可靠性程度，旨在监测和控制本实验室任务的精细度，提高本室常规任务中批内、批间样本检验的一致性，以确定测定结果能否可靠、可否发出报告的一项任务。 .定 义室间质量评价 External Quality Assessment, EQA 为客观比较一实验室的测定结果与靶值的差别，由

2、外单位机构，采取一定的方法，延续、客观地评价实验室的结果，发现误差并校正结果，使各实验室之间的结果具有可比性。这是对实验室操作和实验方法的回想性评价，而不是用来决议在实时的测定结果的可接受性。当EQA用来为执业答应或实验室认证的目的而评价实验室操作时，常描画为实验室才干比对检验Proficiency testing, PT。在以前的文献中，EQA常描画室间质量控制。.定 义 准确度 (Accuracy) 待测物的测定值与其真值的一致性程度。准确度不能直接以数值表示，通常以不准确度来间接衡量。对一分析物反复多次测定，所得均值与其真值或参考靶值之间的差别亦即偏向即为测定的不准确度。 偏向 (Bia

3、s) 待测物的测定值与一可接受参考值之间的差别。.定 义精细度(Precision) 在一定条件下所获得的独立的测定结果之间的一致性程度。与准确度一样，精细度同样也是以不精细度来间接表示。测定不精细度的主要来源是随机误差，以规范差SD和/或变异系数CV详细表示。SD或CV越大，表示反复测定的离散度越大，精细度越差，反之那么越好。 .定 义批 (Run) 在一样条件下所获得的一组测定。 均值Mean 规范差Standard deviation, SD或s 变异系数Coefficient of variation, CV .定 义正态分布(Gaussian distribution) 当一质控物用

4、同一方法在不同的时间反复多次测定，当测定数据足够多时，如以横轴表示测定值，纵轴表示在大量测定中相应测定值的个数，那么可得到一个两头低，中间高，中为一切测定值的均值，左右对称的“钟形曲线，亦即正态分布，又称高斯分布。 .定 义正态分布的根本统计学含义可用均数、规范差s和概率来阐明。.临床基因扩增检验实验室常规测定步骤标本搜集：选择测定工程、标本搜集和保管。实验室测定：标本接纳、贴标签、样本处置、核酸扩增、产物检测、测定的有效性和临床诊疗价值。报告和解释：结果发出、结果解释和临床管理。.质量保证、室内质控和室间质评之间的关系.临床标本搜集、运送、保管及其质量控制 标本搜集 标本保管标本运送 .标本

5、搜集标本采集时间对扩增检测结果的影响 标本采集部位的预备 标本的类型和采集量 采样质量的评价 采样及运输容器 标本采集中的防污染 .标本采集时间对扩增检测结果的影响在疾病开展过程中，标本采集过早或过晚都能够会给出假阴性结果。 .标本采集部位的预备标本采集部位的清洁消毒可去掉污染的微生物或其它杂物,但应适度,过度清洁消毒有能够会去掉或破坏靶微生物,故标本采集部位的预备应由训练有素的人员进展。.标本的类型和采集量标本的类型: 血清(浆)、分泌物、痰、粪便、尿和脑脊液等。标本的采集量:应根据所测病原体而定。普通来说，假设标本的量对病原体培育够用的话，那么其量亦足以用于核酸提取及其后的扩增检测。对于定

6、量测定来说，对标本的搜集要求更为准确。.采样质量的评价血清(浆)标本:溶血、脂血等；分泌物、痰：评价内容包括细胞组成，所需类型细胞的数量和核酸总量。 评价方法：包括肉眼察看,显微镜下察看和化学分析等。 .采样及运输容器 标本的采集资料如棉签应为一次性运用；运输容器亦应为密闭的一次性安装；采样所用的防腐剂、抗凝剂及相关试剂资料不应对核酸扩增及检测过程呵斥干扰。 .标本采集中的防污染 采集中要特别留意污染，防止混入操作者的头发、表皮细胞、痰液等； 如运用玻璃器皿，必需经高压灭菌，以使能够存在的RNase失活。.标本保管 靶核酸(尤其是RNA)易受核酸酶的作用而迅速降解，因此标本的保管对于核酸扩增测

7、定的有效性极为重要。 运用GITC作为稳定剂保管标本，标本可在室温下稳定约7天。 .标本保管临床体液标本长期保管应在-70下。 如为提取核酸后用于DNA扩增分析的样本，可于10 mmol/L Tris,1mmol/L EDTA(pH7.58.0)缓冲液中4 下保管。 用于RNA扩增分析的样本，那么应于上述缓冲液中-80或液氮下保管。 核酸的乙醇沉淀物那么可于-20下保管。 .标本运送 样本一经采集，那么应尽能够快的送至检测实验室。样本中如参与了适当的稳定剂,如用于RNA测定参与GITC的血清(浆)样本和用于DNA测定的EDTA抗凝血等,那么可在室温下运送或邮寄。实验室应根据待测靶核酸的特性，对

8、各种临床样本的运送条件作出相应的规定。.临床基因扩增检验的室内质量控制测定前的质量控制核酸样本的制备及其质量控制 统计学质量控制质量控制的评价.测定前质量控制实验室设备、仪器设备及管理理想的试剂和操作方法 人员培训 .实验室设备、仪器设备及管理临床基因扩增检验实验室应有充分合理的空间、良好的照明和空调设备 ；实验室仪器设备应保养良好，实验用品要到达相应的要求。加样器的校准？带滤塞吸头的运用及质检？离心机？热循环仪？水浴箱和/或恒温干浴仪？酶标仪和洗板机？.基因扩增仪器设备的质控.带滤塞吸头的运用及质检首先制备一个含12%甘油及色素如甲基橙的水溶液，假设吸头的最大体积为100l，那么将加样器汲取

9、体积调至110120l，再套上吸头后汲取上述有色液体。假设吸头质量好，那么有色液体不应出如今滤塞之上，否那么阐明滤塞不严。 .带滤塞吸头的运用及质检用实验来检验带滤塞吸头的质量：先纯化制备数份强阳性和数份阴性核酸标本，然后将加样器汲取量设至扩添加样所需的体积，运用待评价带滤塞吸头对一份强阳性样本来回汲取10次模拟10份阳性样本的汲取，将最后一次的汲取液加至一含扩增反响液的管中，之后，换一个新吸头，延续汲取10份阴性样本分别至10个扩增反响管中，此过程反复35次，最后对每一管按所用试剂方法进展扩增检测。强阳性样本应为强阳性，阳性弱或出现阴性那么阐明吸头能够含有扩增抑制物。一切阴性样本应为阴性，出

10、现阳性那么阐明吸头不能有效地防止气溶胶对加样器的污染。 .扩增仪孔间温度的反复性和均一性的检测方法一是运用一种热电偶探针、微伏转换器和自动图示记录仪组成扩添加热模块孔内温度监测记录系统，当孔间温度变异超出1时，其可测出来。详细做法是将装有TE缓冲液并上加石蜡油的扩增反响管放置于扩增仪各孔中，热电偶探针透过扩增反响管盖插至缓冲液中，然后按程序进展一个常规的PCR扩增，加热模块如为96孔，那么至少要测定12孔不同位置孔内的温度，在整个扩增过程中，可挪动热电偶探针至上述不同孔中监测温度，但每一孔内温度监测至少要有一个扩增周期。 .扩增仪孔间温度的反复性和均一性的检测方法第二种方法并非直接测定孔内温度

11、，而是经过扩增功能来间接获知孔间的均一性，即将加有一知的含一定浓度的阳性质控样本的扩增反响管置于扩增仪各孔中按常规进展扩增检测，察看结果的一致性程度，假设有某一个或几个孔结果有问题，那么应确定这一个或几个孔能否会反复性地得到假阴性结果，假设是，那么阐明相应孔的热传导有损坏。 .理想的试剂和操作方法 试剂盒的质检定量测定的精细度是测定组成步骤的变异和的平方根(SD)= 上式中SDa、SDb、SDc是步骤a、b、c等例如试剂预备、标本采集、核酸提取、扩增和产物检测等的规范差； .理想的试剂和操作方法改善测定精细度的措施必需首先着重在最不精细的步骤上，应对试剂预备、标本搜集、核酸提取、测定方法和仪器

12、操作写出“规范操作程序(SOP) .人员培训 临床基因扩增检验的操作主要是标本处置中的核酸提取步骤，这其中所涉及的又主要是加样器的运用，虽然操作简单，但由于均为微量操作，要获得稳定可靠的测定结果，操作人员需求一定的专业技术知识和阅历，要尽能够做到知其然又知其所以然。 .核酸样本的制备、扩增检测及其质量控制普通核酸提取试剂促使靶核酸从细胞内释出的原理核酸的分别纯化靶核酸提取的质量 临床标本及核酸提取中能够存在的抑制和干扰物质 核酸样本制备及扩增检测的质控 产物检测的质控 .普通核酸提取试剂促使靶核酸从细胞内释出的原理靶核酸可以与宿主细胞整合，核内游离及胞浆内各种构形存在于细胞内，如测定的是病原微

13、生物,那么靶核酸存在于细菌、病毒、原虫或真菌细胞内，假设上述细胞破裂,那么靶核酸亦可存在于细胞外。 普通均运用去垢剂(如Triton-100)裂解细胞，用一种蛋白裂解酶(如蛋白酶K)消化结合于核酸的蛋白质，从而将靶核酸从细胞内释放出来。.核酸的分别纯化 核酸的分别纯化就是要将蛋白、脂类等干扰核酸扩增的物质去除。 经典方法硅吸附法对于商品核酸提取试剂盒，临床实验室在运用前，必需对其核酸提取纯度和效率进展评价。 .靶核酸提取的质量 纯化的靶核酸的完好性：可运用凝胶电泳将样本的核酸提取物与一核酸规范比较测定。 核酸提取的产率：可在A260读数测定。核酸纯度：可经过提取物A260/A280比率断定血清

14、或血浆中病原体核酸纯化纯度：采用一种间接的方法，即使用知病原体含量的溶血和/或脂血标本用待评价试剂提取，然后进展扩增检测，比较所得到的结果 .临床标本及核酸提取中能够存在的抑制和干扰物质 临床标本中：血清或血浆中的血红素及其代谢产物、痰中酸性多糖和糖蛋白成份 、降解靶核酸的核酸酶等。核酸提取中：许多试剂如乙二胺四乙酸(EDTA)、去垢剂如十二烷基硫酸盐(SDS)和chaotrope试剂如异硫氰酸胍和盐酸胍等、酚、氯仿、乙醇等有机溶剂 。 .核酸样本制备及扩增检测的质控对临床标本中能够存在的抑制/干扰物的质控措施 核酸提取及扩增有效性的质控 .对临床标本中能够存在的抑制/干扰物的质控措施质控措施

15、： 采用内质控internal control, IC通常称为内标的方法 内标有两种,即竞争性的和非竞争性的内标。 内标设置的必要性？.核酸提取及扩增有效性的质控 知弱阳性质控样本基质与待测标本一样：至少带1份，其最后的检测结果，应是核酸提取和扩增检测的有效性的综合反映。知阴性质控样本基质与待测标本一样：至少带1份，扩增测定的结果可以判别核酸提取过程中能否发生污染。 .统计学质量控制 理想的室内质控样本的条件测定中质控样本的设置、数量及陈列顺序 统计学质控的特点 统计质控方法.理想的室内质控样本的条件基质与待测样本一致；所含待测物浓度接近实验的决议性程度；稳定；靶值或预期结果已定；无知的生物传

16、染危险性；单批可大量获得；价廉.测定中质控样本的设置、数量及陈列顺序每次检测终究运用几个质控样本并排在临床标本中的哪个位置最为适宜？从实际上说，为最大能够地检出实验的随机和系统误差，应每隔几份临床标本插入1份质控样本，但思索国内目前的实践情况及本钱效益，普通来说，假设临床基因扩增检验的标本量不是特别大，定性测定有一份接近cut-off的弱阳性和一份阴性质控样本应可以满足要求。而定量测定那么要根据实验的测定范围，采用高、中、低三种浓度的质控样本。至于在测定中的陈列顺序，可排于规范品或校准品之后，临床样本之前。 .临床基因扩增检验室内质控的独特性即监测污染发生的阴性质控的设置。 应该包括1份阴性原

17、血清样本、1份在标本核酸提取过程中带入的一个空管和仅含扩增反响混合液的管。 .阴性原血清质控样本的功能 监测实验室的以前扩增产物的污染； 由实验操作所致的标本间的交叉污染；扩增反响试剂的污染。 .在标本核酸提取过程中带入的一个空管的功能根本功能与阴性原血清质控样本一样，但不同的是，其基质为水，不含阴性原血清质控样本中能够有的扩增抑制物，因此对污染的反映更为灵敏；不能取代原血清阴性样本。.仅含扩增反响混合液的管的功能监测扩增试剂能否发生污染，具有较强的污染鉴别性。如想鉴别实验室能否发生污染，可将一个或多个空管翻开静置于标本制备区3060分钟，然后参与扩增反响混合液同时以水替代核酸样本扩增，如为阳

18、性，而上述仅含扩增反响混合液的管为阴性，那么阐明实验室以前扩增产物的存在。 .统计学质控的特点 检验误差有两类，一是系统误差，一是随机误差。系统误差通常表现为质控物测定均值的漂移，是由操作者所运用的仪器设备、试剂、规范品或校准物出现问题而呵斥的，这种误差可以经过前述的措施方法加以控制，是可以排除的。随机误差那么表现为测定SD的增大，主要是由实验操作人员的操作等随机要素所致，其出现难以完全防止和控制。.统计学质控的功能统计学质控的功能就是发现误差的产生及分析误差产生的缘由，采取措施予以防止。开展统计质量控制前，应将可以控制的误差产生要素尽能够地加以控制，这不但是做好室内质控的前提，也是保证常规检

19、验任务质量的先决条件。 .统计质控方法 基线测定质控规那么的表达方式及定义 Levey-Jennings质控图方法 Levey-Jennings质控图结合Westgard多规那么质控方法 累积和 (CUSUM) 质控方法 “即刻法质控方法 .基线测定最正确条件下的变异Optimal conditions variance, OCV和常规条件下的变异Routine conditions variance, RCV； 当RCV与OCV接近，或小于2 OCV时，那么RCV是可以接受的。以上为批间变异。批内变异的测定；室内质控物的测定准确度的评价。 .临床基因扩增检验IQC统计计算问题可运用质控样本扩

20、增后的拷贝数/ml或IU/ml来进展统计计算，也可用其对数值进展。由于基因扩增结果的原始数据通常很大，故运用其对数值来进展质控统计分析能够要更为方便一些。 .质控规那么的表达方式及定义 质控规那么的表达方式 质控规那么的功能 常用质控规那么的符号及定义 .质控规那么的表达方式通常质控规那么以符号AL来表示，其中A为质控测定中超出质量控制限的测定值的个数，L为控制限，通常用均值或均值13SD来表示。 当质控测定值超出控制限L时，即可将该批测定判为失控。 常用的13S质控规那么，其中1为原式中的A，3s为原式中的L，表示均值3s，其确切的含义为：在质控测定值中，假设有一个测定值超出均值3s范围，即

21、可将该批测定判为失控。 .质控规那么的功能 简单地说就是用于判别测定批的失控还是在控 。当整个质控过程中运用同一个质控物时，可用来判别单个或多个测定批内该质控物的测定值能否失控； 当整个质控过程中运用两个或两个以上的不同的质控物时，可用来判别同一或多个测定批内的两个或两个以上的质控物的测定值能否失控。 .常用质控规那么的符号及定义 符 号 定 义12S 一个质控测定值超出2s控制限。13S 一个质控测定值超出3s控制限。22S 两个延续的质控测定值同时超出+2s或2s控制限。R4S 同一批测定中，两个不同浓度质控物的测定值之间的 差值超出4s控制限。31S 三个延续的质控测定值同时超出+1s或

22、1s控制限。41S 四个延续的质控测定值同时超出+1s或1s控制限。7X 七个延续的质控测定值同时处于均值的同一侧。7T 七个延续的质控测定值呈现一个向上或向下的趋势变化。8X 八个延续的质控测定值同时处于均值的同一侧。9X 九个延续的质控测定值同时处于均值的同一侧。10X 十个延续的质控测定值同时处于均值的同一侧。.Levey-Jennings质控图方法 也称Shewhart质控图，是由美国的Shewhart于1924年首先提出，并用于工业产品的质量控制。后来二十世纪五十年代初，Levey-Jennings将其引入临床检验的质量控制 。经Henry和Segalove的改良，即为目前常用的Le

23、vey-Jennings质控图。.质控图.质控图.Levey-Jennings质控图根本的统计学含义稳定条件下，在20个IQC结果中不应有多于1个结果超越2SD95.5%可信限限制；在1000个测定结果中超越3SD99.7%可信限的结果不多于3个。如以3s为失控限，假失控的概率为0.3%。 .质控图的记录的其它方面IQC数据是用来控制实践过程的，因此其表达应清楚和直接，在质控图上记录结果时，应同时记录测定的详细情况，如日期、试剂、质控物批号和含量及测定者姓名等。 .Levey-Jennings质控图方法的特点优点是简单明了；缺陷： 以2s为失控限，假失控的概率太高，通常不能接受； 以3s为失控

24、限，假失控的概率低，但误差检出才干不强。 .Levey-Jennings质控图结合Westgard多规那么质控方法 Westgard多规那么质控方法即是将前述的多个质控规那么同时运用进展质控判别的方法。最初常用的有六个质控规那么，即12S、13S、22S、R4S、41S和10X，其中12S规那么作为告警规那么，当出现质控测定值违反12S规那么时，那么起动其它规那么进展判别。只需当运用一切质控规那么判别确定某测定批在控时才阐明该测定批在控，只需上述质控规那么之一判别测定批失控那么即以为该测定批失控。通常上述规那么中，13S和R4S规那么反映的是随机误差，而22S、41S和10X反映的是系统误差，

25、系统误差超出一定的程度，也可从13S和R4S规那么反映出来。 .Westgard多规那么质控方法的特点其是在Levey-Jennings质控图方法的根底上产生的，自然也就具有Levey-Jennings质控图方法的优点，可经过类似的质控图来进展分析； 假失控和假告警概率低； 误差检出才干加强 。.累积和 (CUSUM) 质控方法累积和 (CUSUM) 质控方法于1977年由Westgard等提出,对系统误差有较好的测出才干。 .常用的累积和 (CUSUM) 质控规那么 质控规那么 起动累积和计算的阈值k 质控限h 1.0s 2.7s 1.0s 3.0s 0.5s 5.1s.累积和 (CUSUM

26、) 质控详细步骤 与上述其它质控方法一样,首先得到测定均值和规范差(s) ;确定起动累积和计算的阈值k和质控限h; 确定质控规那么; 绘制质控图;累积和(CUSUM)计算;如有失控，那么采取措施予以纠正，再开场上述累积和计算。 .累积和 (CUSUM) 质控图.“即刻法质控方法 “即刻法质控方法的本质是一种统计学方法,即Crubs异常值取舍法 ；只需有3个以上的数据即可决议能否有异常值的存在。 .“即刻法质控方法详细步骤 将延续的质控测定值按从小到大陈列，即x1、x2、x3、x4、x5、x6、xnx1为最小值，xn为最大值； 计算均值()和规范差(s);按下述公式计算SI上限和SI下限值； S

27、I上限=x最大值 均值/s SI下限=均值 x最大值 /s将SI上限和SI下限值与SI值表中的数值比较。 .质控结果的判别 SI上限和SI下限值均 n3s对应的值时，阐明该质控测定值的变化已超出3s，属“失控。.室内质控数据的评价 IQC为一集体活动，除实践测定者外，还应有另外一人对测定数据进展质检。不能将IQC作为一个监察方法，当发现一次测定未到达质量规范时，应以建立性的而非批判的方式去探查失控的缘由。除了将IQC数据作为日常质控外，还应定期评价累积数据以监测在测定操作中的长期变化趋势。评价应定期进展。.弱阳性质控样本常见的失控缘由 核酸提取中的随机误差。如核酸提取中的丧失、有机溶剂的去除不

28、彻底、标本中扩增抑制物的残留等。 仪器的问题。如扩增仪孔间温度的不均一性、孔内温度与所示温度的不一致性等。 试剂的问题。如Taq酶和/或逆转录酶的失活、探针的纯度及标志效率和核酸提取试剂的效率等。 .阴性质控样本的失控缘由 主要为扩增产物的“污染和/或临床标本的核酸提取过程中发生的标本间的交叉 “污染. .室内质控的局限性IQC可确保每次测定与确定的质量规范一致，但不能保证在单个的测定样本中不出现误差。比如样本鉴别错误、样本汲取错误、结果记录错误等。此类误差的发生率在不同的实验室有所不同，普通要求小于0.1%，且应均匀地分布于测定前、测定中和测定后的不同阶段。.影响临床基因扩增检验结果的最关键要素产物“污染Carry-over)测定人员的操作：标本混淆；贴错标签、核酸提取等试剂.防止基因扩增检验假阳性结果的措施严厉的实验室分区；运用带“滤心的吸头；设立“阴性质控与标本同时处置；运用防“污染含UNG的PCR试剂；临床“假阳性问题：病原微生物如结核杆菌经药物治疗后已死亡，但PCR仍可为阳性，故治疗终了后至少两周内不宜做PCR检测。.防止基因扩增检验假阴性结果的措施防止由于来自于标本的血红蛋白、肝素、某些激素或来自标本处置中的去垢剂、有机溶剂的抑制造用的措施：纯化核酸；标本反复双份测定；