重组致倦库蚊对常用农药的敏感谱与代谢谱分析——陈鹏超

1、重组致倦库蚊酯酶对常用农 药的敏感谱与代谢谱分析 重组致倦库蚊对常用农药的敏感谱与代谢谱分析陈鹏超团队成员朱桢楠指导老师:蒋彩英1234陈鹏超其成李珊珊重组致倦库蚊对常用农药的敏感谱与代谢谱分析陈鹏超目 录 研究背景 研究内容 实验结果 结果分析 工作计划重组致倦库蚊对常用农药的敏感谱与代谢谱分析陈鹏超研究背景1983年我国农药使用量为0.86亿吨2003年农药使用量1.32亿吨重组致倦库蚊对常用农药的敏感谱与代谢谱分析陈鹏超研究背景40%50%水稻棉花农药使用过量所占比例重组致倦库蚊对常用农药的敏感谱与代谢谱分析陈鹏超研究背景2012年1月绿色和平先后在北京、成都和海口对九个茶叶品牌进行了随

2、机抽样调查: 被调查的九个品牌的所有茶叶样品上均含有至少三种农药残留; 检出的农药种类总数高达29种; 六个样本含有十种以上农药残留，而日春803铁观音竟含有多达17种农药残留。重组致倦库蚊对常用农药的敏感谱与代谢谱分析陈鹏超研究背景目前主要的检测方法：薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法和快速检测法如酯酶抑制法及其基础上发展形成的酶生物感应器等。薄层色谱法：准确度不高气相色谱法、液相色谱法：灵敏度好，准确度高，但需要的仪器设备投入大，操作复杂，检测成本高，也不便于现场检测。以酯酶为基础的快速检测法：具有前处理简便、检测时间短、所需设备简单和适于现场测定等优点，但受到酶源数量、灵敏度、选择性

3、和稳定性等因素影响。因此，寻求稳定、高质量的酶源是关键。重组致倦库蚊对常用农药的敏感谱与代谢谱分析陈鹏超研究背景 致倦库蚊酯酶 致倦库蚊全基因组序列测定完成，为研究库蚊体内酯酶同工酶基因提供了信息基础，亦为开发和利用库蚊酯酶用于农药残留快速检测和农药污染治理提供了基因资源。致倦库蚊是世界上入室吸血骚扰的主要蚊种和班氏丝虫病的主要传病媒介。近几年来，由于化学杀虫剂大量使用，导致库蚊普遍产生抗药性。因此，抗药致倦库蚊中的酯酶还可为环境中农药污染的生物修复提供丰富酶源。重组致倦库蚊对常用农药的敏感谱与代谢谱分析陈鹏超研究内容对致倦库蚊酯酶基因CqE9进行生物信息学分析，从而制定相应的实验方案克隆致倦

4、库蚊酯酶基因CqE9 构建重组表达质粒pET32-CqE9 重组表达载体在大肠杆菌Rosetta菌株中的表达 致倦库蚊酯酶基因CqE9重组蛋白纯化与酶活分析重组致倦库蚊对常用农药的敏感谱与代谢谱分析陈鹏超实验结果致倦库蚊酯酶基因CqE9酯酶基因CqE9是从致倦库蚊4龄幼虫中克隆获得的，基因ORF全长1623bp，编码540aa图为致倦库蚊CqE9基因ORF及其推测的氨基酸序列重组致倦库蚊对常用农药的敏感谱与代谢谱分析陈鹏超实验结果图为 CqE9疏水性分析注：1. 0 以上表示疏水性，分值越高疏水性越强 2. 0 以下表示亲水性，分值越小亲水性越强利用ProtScale程序分析CqE9蛋白的疏水

5、性，该蛋白的疏水性最大值为2.411，最小值为-2.633；由于该氨基酸序列亲水性明显强于疏水性，故推测CqE9蛋白为亲水性蛋白。重组致倦库蚊对常用农药的敏感谱与代谢谱分析陈鹏超实验结果利用SignalP 4.0服务器分析发现CqE9不存在信号肽重组致倦库蚊对常用农药的敏感谱与代谢谱分析陈鹏超实验结果经MHMM服务器对CqE9跨膜分析，发现不存在跨膜结构。重组致倦库蚊对常用农药的敏感谱与代谢谱分析陈鹏超实验结果 利用PROSITE分析CqE9序列的功能区，发现在178-193bp区域存在羧酸酯酶B型丝氨酸活性位点(Carboxylesterases type-B serine active s

6、ite)：FGGdpknItLfGeSAG。 综上，致倦库蚊CqE9基因为羧酸酶酯基因，ORF全长1623bp，编码540aa，不含信号肽序列，不存在跨膜结构区域。重组致倦库蚊对常用农药的敏感谱与代谢谱分析陈鹏超实验结果 致倦库蚊酯酶基因CqE9重组表达载体构建与原核表达引物序列为:Primer1： 5-CCA TGG CTG ATG GAC GTC GAA CATPrimer2： 5-GGC CGC TCG AGC TAA TAA AGC TTA TC M 1 M: DNA Marker；1:PCR产物 1.6kb重组致倦库蚊对常用农药的敏感谱与代谢谱分析陈鹏超实验结果 致倦库蚊酯酶基因Cq

7、E9重组表达载体构建与原核表达最佳表达条件 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 泳道1、3、5分别为IPTG终浓度为0.5 mM诱导3h、2h、1h后的细菌匀浆液上清；泳道2、4、6分别为IPTG终浓度为0.5 mM诱导3h、2h、1h后的细菌匀浆液沉淀；pET32-CqE9在不同诱导表达条件下的SDS电泳图泳道M为蛋白Marker（分子量条带自上而下分别为170KD、130 KD 、95 KD 72 KD 、55 KD、43 KD 和34KD）箭头所示为目的融合蛋白泳道7、9分别为IPTG终浓度为0.25 mM和0.1 mM诱导2h后的细菌匀浆液上清；泳道8、10分别为

8、IPTG终浓度为0.25 mM和0.1 mM诱导2h后的细菌匀浆液沉淀；泳道11、12分别诱导3hr的含pET-32a(+)空载体的菌蛋白上清和沉淀；诱导表达最佳条件为0.1mM IPTG在28oC下诱导表达2hr重组致倦库蚊对常用农药的敏感谱与代谢谱分析陈鹏超实验结果 致倦库蚊酯酶基因CqE9重组蛋白纯化His亲和层析法酶液酶活力（mOD/min/g）蛋白量（mg）比率未诱导酶粗提液7.6100.7480.2200.085诱导酶粗提液20.3342.1770.1580.0201.0诱导酶流出液6.4370.6480.0860.006诱导酶清洗液119.1720.5540.0220.000诱导

9、酶清洗液2258.48323.5940.0010.001诱导酶洗脱液442.20522.9100.0160.00121.75注: 表中显示为重组酶蛋白纯化各部分酶活性重组致倦库蚊对常用农药的敏感谱与代谢谱分析陈鹏超实验结果 致倦库蚊酯酶基因CqE9重组蛋白纯化His亲和层析法泳道1为未经诱导的细菌匀浆液上清；泳道2为经诱导的细菌匀浆液上清；泳道3为诱导的细菌匀浆液上清经过His亲和柱的流出液（Flow through）；泳道4、5分别流经His亲和柱的清洗液；泳道6为洗脱液。箭头所示为目的融合蛋白。 M 1 2 3 4 5 6 pET32-CqE9重组蛋白纯化的SDS电泳图 泳道M： 蛋白Ma

10、rker（分子量条带自上而下分别为170KD、130 KD 、95 KD 72 KD 、55 KD、43 KD 和34KD）结果表明利用His亲和层析方法可有效纯化重组蛋白，纯化效率在21.75倍。重组致倦库蚊对常用农药的敏感谱与代谢谱分析陈鹏超实验结果致倦库蚊酯酶基因CqE9重组蛋白酶活分析化合物面积比率A3-PBA32.20.056 氯菊酯576.6- B3-PBA30.40.065 氯菊酯466.7- C3-PBA61.00.131 氯菊酯464.0- 图为重组酶蛋白对氯菊酯的离体代谢HPLC分析A: 阴性对照（不含酶液）B: 阳性对照（热灭活酶液）C: 处理（活性酶液）。其中，比率=

11、3-PBA面积 / 氯菊酯面积。重组致倦库蚊对常用农药的敏感谱与代谢谱分析陈鹏超结果分析 成功克隆致倦库蚊酯酶基因CqE9，成功构建pET32-CqE9 重组质粒； 探索得最佳诱导条件：0.1mM IPTG在28oC下诱导表达2hr； 探索得最佳纯化方法为His亲和层析法。重组致倦库蚊对常用农药的敏感谱与代谢谱分析陈鹏超结果分析重组酶蛋白在5端含有部分的载体氨基酸序列（包括His-tag等），是否会对酶活性及其酶学特征产生影响，尚不清楚； 在重组酶蛋白对农药代谢分析时拟采用GC-MS方法，以提高检测灵敏度，但相关的检测条件尚待优化；检测工作量大。重组致倦库蚊对常用农药的敏感谱与代谢谱分析陈鹏超实验