41 生鲜肉中三聚氰胺的测定 DB21／T 1687

1、ICS 65. 120B 46备案号：DB21辽 宁 省 地方 标 准DB21/T 16872008生鲜肉中三聚割胺的测定Detemiiiiation of Melamine in Fresh Meats2008-12-01 实施2008-11-19 发布辽宁省质量技术监督局发布本标准由辽宁省动物卫生监督管理局提出并归I I。本标准由辽宁省质量技术监督局发布。本标准附录A为资料性附录。本标准负责起草单位：农业部饲料质量及畜产品安全监督检验测试中心（沈阳）。本标准起草人：王淑芬张建勋刘全刘敬先刘凯杨希国于家丰王丽娜田晓玲曲韵坤。 本标准首次发布。生鲜肉中三聚机胺的测定1范围本标准规定了生鲜肉中三

2、聚氤胺残留检测的制样和酶联免疫(ELISA)、高效液相色谱(HPLC)、 气相色谱-质谱法(GC -MS)测定方法。本标准适用于生鲜猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉中三聚氤胺残留检测。本标准中的酶联免疫法为筛选方法，筛选结果为阳性的样品需要用仲裁法确证，高效液相色谱法和 气相色谱-质谱法为定量方法，其中气相色谱-质谱法为仲裁法。酶联免疫法定量限为0 20mg/kg,高效液 相色谱法定量限为OEOmg/kg,气相色谱-质谱法定量限为O.lOmg/kg。2规范性引用文件卜.列文件的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注口期的引用文件，其随后所有的修 改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，

3、然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是 否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6682分析实验室用水规则和试验方法3制样3.1试样的制备从原始样品中分取出约500g,经绞肉机绞碎、匀质使均匀。3.2试样的保存-20C以下贮存。4酶联免疫法1原理本方法基于酶联免疫法中的竞争性测定法原理，通过样品萃取物中的三聚氤胺与三聚氤胺酶标记物 竞争结合微孔中的三聚氤胺抗体，除去未结合的三聚氤胺酶标记物后，结合的酶标记物将无色的底物转 化为蓝色的物质，加终止液后在450nm卜读取各微孔吸光度值。吸光度值与样品中的三聚氤胺含量成反 比。4.2试剂和溶液2. 1除

4、特殊注明外，本标准所用试剂均为分析纯。水应符合GB/T 6682二级水的规定。2.2三聚氤胺试剂盒(附系列标准品溶液，酶标记物，清洗液、底物，终止液，说明书)。2.3 异辛烷(CSH1S)2.4三氯甲烷(CHC13)2.5异辛烷+三氯甲烷混合液：准确量取40ml异辛烷(4.2.3 )和60ml三氯甲烷(4 2.4),混匀即得。2. 6 10% 甲醇/ZOmMPBS：称取 0.62gNaH2PO4-H2O, 5.73gNa2HPO4-12H2O 和 9gNaCl 用蒸循水溶解, 并定容至lOOOmL,取此溶液900inL,加入lOOinL甲醇混匀即得。4.3仪器和设备3. 1酶标仪(带450nm

5、滤光片)。3.2涡旋混合器。3. 3 冷冻离心机。3.4 微量加样器：20uL. 50uLs lOOuL. 150uL. 250uLo3.5恒温干燥箱。3. 6分析天平：感量0 01g。3.7振荡器绞肉机匀浆机4.4测定步骤4.1样品处理准确称量3g试料(3.1)精确到0 01g,加入10mL10%甲醇/ZOmMPBS (416),涡旋30s,振荡5min, 4000i/min离心5min,取3mL上清液加入2mL异辛烷+三氯甲烷混合液(4 2.5 ),混匀，4000r/min离心5min, 静置，取上层150pL待测。4.2测试程序取出欲测数量的微孔条安插在酶标板上，分别吸取Oyg/L、20

6、pg/L、lOOug/L. 250ug/L. 500ug标 准溶液(4.2.2)和试样萃取液(44.1)各150pL至包被有三聚氤胺抗体的对应微孔中，分别加入50pL 三聚氮胺酶标记物溶液，振荡使混匀，25C左右孵育30mm。倾尽酶标板，清洗液(42.2)洗板4次， 拍干。力niOOuL底物(4.2.2)至每个微孔中，振荡使混匀,25C左右孵育30mm iniOOuL终止液(4.2.2) 至每个微孔中，振荡混匀，450nm下读取各微孔吸光度值。注：不同品牌的试剂盒其操作步骤可能略有差异，比如稀释倍数，具体操作步骤可根据试剂盒使用说明书略作调整。 试剂盒使用前恢复到室温。标准和样品做平行试验以增

7、加准确性。5结果计算以空白溶液(浓度为0的标准溶液)的吸光度值为10阳作为计算基准，折算出各标准溶液和试样萃 取液的相对吸光度值。相对吸光度值(%)=标花吸光度值：或试料萃取液吸光度值I】。 . (1)空白吸光度值绘制标准相对吸光度值与浓度(ug/L)关系曲线，校正曲线在20ugZL-500ug/L范围内为线性。试样 萃取液的浓度可以从校正曲线上读出。5高效液相色谱法1原理试料中的三聚氤胺经三氯乙酸和乙酸铅提取并沉淀蛋白、三氯甲烷去除脂溶性杂质，混合型阳离子 交换固相萃取小柱净化，高效液相色谱仪测定，外标法定量。5.2试剂和材料除特殊注明外，本标准所用试剂均为分析纯。除色谱用水应符合GB/T

8、6682一级水的规定外，水应 符合GB/T 6682二级水的规定。2. 1三聚氤胺对照品：含三聚氤胺(C3H6N6)不得少于95 0%。2.2 三氯甲烷(CHC13)o2. 3乙腊(CH3CN)：色谱纯。2.4甲醇(CH3OH):色谱纯。2.5 庚烷横酸钠(C7H15SO3Na) 02.6 柠檬酸(C6HsO7*H2O ) 02.7 氨水(NH3H2。)o2.8氮气(Xj)：普通氮气。2.9 0 122molZL三氯乙酸溶液：准确称取三氯乙酸20g于1 OOOmL容量瓶中，用水溶解后定容至刻 度。2. 10 0.058mol/L乙酸铅溶液：准确称取乙酸铅32g于WOOinL容量瓶中，用水溶解后

9、定容至刻度。5.2. 11 80%甲醇溶液：准确量取80mL甲醇(5.2.4)于100inL容量瓶中，用水定容至刻度。2. 12 5%氨化甲醇溶液：准确量取5mL氨水(5.2.7)于lOOinL容量瓶中，用甲醇(5.2.4)定容至 刻度，现用现制。2. 13离子对缓冲溶液：称取2.02g庚烷横酸钠(5.2.5)和3.10柠檬酸(5.2.6)于1000mL容量瓶中， 用水稀释至刻度，摇匀。2. 14三聚氤胺标准储备液：精确称取约50mg三聚氤胺标准品(5.2.1),精确到0.0001g,置50mL 棕色容量瓶中，用80%甲醇溶液(5.2.11)溶解并定容至刻度，配制成浓度为Img/mL的标准储备

10、液， 于4C避光保存。2. 15三聚氤胺标准中间液：用移液管准确吸取5.00mL标准贮备液(5.2.14)于50mL棕色容量瓶中， 用80%甲醇溶液(5.2.11)定容至刻度，配成浓度为100pg/mL的标准中间液。2. 16 三聚氤胺标准工作液：分别准确吸取0.50mL、1 00mL、2.50mL、5.00mL、lO.OOinL的标准中 间液(5 2.15)于100mL容量瓶中，用80%甲醇溶液(5.2.11)定容至刻度，配制浓度为0.50、1.00、 2.50、5.00、lO.OOg/mL 的标准工作液。5.3仪器和设备3.1高效液相色谱仪(配紫外检测器)。5. 3.2 色谱柱：SB-Cr

11、 或 SB-C$柱。5. 3.3分析天平：感量0 0001 go5. 3.4天平：感量O.Olgo5. 3.5组织匀浆机。5. 3.6 匀浆杯：SOniLo离心机5. 3.8 离心管：50niLo5. 3.9混合型阳离子交换固相莘取柱：60mg/3mL,5. 3.10固相萃取装置。5. 3.11氮气吹干仪。5. 3.12涡旋混合器。5. 3.13振荡器。5. 3. 14微孔滤膜：0 45呻。5.4测定5. 4. 1提取取(3005) g试料(3.1),置50mL离心管中，依次加入10mL三氯乙酸溶液(5.2.9)、2mL乙酸 铅溶液(5.2.10)、3mL三氯甲烷(5.2.2),涡旋30s使其

12、充分混匀，中速振荡提取10min, 10000i/min 离心5min,取上清液备用。净化依次用3mL甲醇(524)、3mL水活化混合型阳离子交换固相莘取柱(5.3.9)，取备用上清液(5.4.1) 全部过柱，再依次用3mL水、3mL甲醇(5.2.4)淋洗，抽干。用5mL氨化甲醇溶液(5.2.12)洗脱，收 集洗脱液置试管中。于60C下用氮气吹干，加入l OOmL甲醇溶液(5.2.11)于试管中，涡旋10s,用微孔 滤膜(5.3.14)过滤，滤液供高效液相色谱仪分析。测定4. 3.1色谱条件色谱柱：SB-Cis或SB-C8柱，粒度5pm, 25cmx4 6mm (ID)。流动相：900mL离子

13、对缓冲溶液(5.2.13) : 100mL乙腊(5.2.3),摇匀。检测波长：240nmo柱温：30Co流速：l.OmL/min。进样体积：ZOliLo4. 3. 2 测定取试样溶液和相应的标准工作液，作单点或多点校准，外标法定量。标准工作液及试样液中三聚氤 胺的响应值均应在仪器检测的线性范围之内。4.4空白试验除不加试料外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。5.5结果计算与表述试料中三聚氤胺的残留量按式(2)计算：AxCxVxlOOOX= (2)A; xMxlOOO式中：X试料中三聚氤胺的含量，单位为亳克每千克(mg/kg):C标准溶液中三聚氤胺的浓度，单位为微克每亳升(pg/mL)；A试

14、样溶液中三聚氤胺的峰面积；A.标准溶液中三聚氮胺的峰面积；M供试试样质量，单位为克(g) oV试样溶液最终定容体积，单位为亳升(mL) 注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。5.6方法灵敏度、准确度、精密度6. 1灵敏度三聚氤胺在猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉中的定量限为0.20ing/kgQ准确度本方法在0.50mg/kglO.OOmg/kg添加浓度的回收率为80%110%。精密度本方法的批内变异系数15%,批间变异系数20%o标准溶液色谱图、猪肉样品空白色谱图、猪肉样品回收色谱图见附录A中图A1、图A 3和图A 3。6气相色谱-质谱法1原理试料中残留的三聚

15、氤胺经三氯乙酸和乙酸铅提取并沉淀蛋白、三氯甲烷去除脂溶性杂质，经混合型 阳离子交换固相萃取小柱净化，双三甲基三氟乙酰胺和三甲基氯硅烷衍生，气相色谱-质谱仪测定，以 m/z327碎片离子色谱峰面积定量。6.2试剂和材料除特殊注明外，本标准所用试剂均为分析纯。水应符合GB/T 6682二级水的规定。2. 1三聚氤胺对照品：含三聚林胺(C3H6N6)不得少于95 0%。2.2 三氯甲烷(CHC13)o2. 3乙腊(CH3CN)：色谱纯。2.4甲醇(CH3OH):色谱纯。2.5 庚烷横酸钠(C7Hi5SO3Na) o2.6 柠檬酸(C6HsO7*H2O ) o2. 7 氨水(NH3H2。)o2.8氮气

16、(Xj)：普通氮气。2.9毗呢(CM：优级纯。2. 10双三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA) +三甲基氯硅烷(TMCS)=99:lo2. 11 0.122mol/L三氯乙酸溶液：准确称取三氯乙酸20g于1 OOOmL容量瓶中，用水溶解后定容至刻 度。2. 12 0.058mol/L乙酸铅溶液：准确称取乙酸铅32g于WOOmL容量瓶中，用水溶解后定容至刻度。2. 13 80%甲醇溶液：准确量取80mL甲醇(6.2.4)于100inL容量瓶中，用水定容至刻度。2. 14 5%氨化甲醇溶液：准确量取5mL氨水(6.2.7)于lOOinL容量瓶中，用甲醇(6.2.4)定容至 刻度，现用现制。2. 15

17、称取2 02g庚烷横酸钠(6 2.5)和2.10柠檬酸(6 2.6)于1000mL容量瓶中，用水稀释至刻度, 摇匀。2. 16三聚氤胺标准贮备液：精确称取约50mg三聚氤胺标准品(6.2.1),精确到0.0001g,用80% 甲醇溶液(6 2.13)溶解并定容至刻度，配制成浓度为Img/mL的标准储备液，于4C避光保存。6. 2. 17三聚氤胺标准中间液：吸取5 00mL标准贮备液(6.2.16)于50mL棕色容量瓶中，用80%甲 醇溶液(6 2.13)稀释、定容，配成浓度为100pg/mL的标准中间液。6. 2. 18三聚氤胺标准工作液：吸取LOOmL标准中间液(6.2.17)于lOOtnL

18、容量瓶中，用甲醇(6.2.4) 稀释、定容至浓度为1.00pg/mL的标准工作液。6.3仪器和设备6. 3.1气相色谱-质谱仪。6. 3.2毛细管柱：HP-5MS毛细管柱。6. 3.3分析天平：感量0 0001 go6. 3.4天平：感量O.Olgo6. 3.5组织匀浆机。6. 3.6 匀浆杯：30mLo6. 3.7离心机。6. 3.8 离心管：50mLo6. 3.9混合型阳离子交换固相莘取柱：60mg/3mL,6. 3.10固相莘取装置。6. 3.11氮气吹干仪。3.12涡旋混合器。3. 13振荡器。3.14微孔滤膜：孔径0.22pm,有机相。6.4测定4. 1提取取(20.05) g试料试

19、料(3.1),置50mL离心管中，依次加入10mL三氯乙酸溶液(6.2.11)、2mL 乙酸铅溶液(6.2.12)、3mL三氯甲烷(612),涡旋30s使其充分混匀，中速振荡提取lOmin, 1000017mm 离心5min,取上清液备用。净化依次用3mL甲醇(6.2.4)、3mL水活化混合型阳离子交换固相萃取柱(6 3.9),取备用上清液(6 4.2) 全部过柱，再依次用3mL水、3mL甲醇(62.4)淋洗，抽干。用5mL氨化甲醇溶液(62.14)洗脱。衍生化将洗脱液（或根据洗脱液中三聚氤胺的浓度用甲醇适当稀释）在60C下用氮气吹干，加入300pL毗 呢和200iL的衍生化试剂（6.2.10

20、）,涡旋混匀，密封玻璃塞，70C在恒温干燥箱中反应30min,冷却后 用微孔滤膜（6.3.14）过滤，滤液用气相色谱-质谱仪测定。6. 4.4标准曲线的制备分别准确吸取1 00ug/mL标准工作液（6.2.18） O.linL, 0.3mL, 0.3mL, 0.4mL, 0.5mL置具塞小试 管，按643衍生后，（因试样溶液最终定容体积为0.5ml,则对应浓度对应分别是0.午g/mL, 0.4ug/mL, 0.6iig/mL, OSjig/mL, 1.0pg/mL）气相色谱-质谱仪测定。每一个浓度重复测定2次，测得的峰面积平均 值与对应浓度绘制标准曲线，拟合，求得回归方程和相关系数。测定6.

21、4. 5. 1气相色谱一质谱条件色谱柱：HP-5MS毛细管柱或相当者。载气：嬴气，流速为1.3mL/min。进样量：1iL。进样口温度：260Co升温程序：起始温度75 C,持续1 Online 30 C/min升温至300lC，保持2.0mm。传输线温度：280-Co运行时间：105mm。扫描范 I韦I ： 60m/z1-00m/z。扫描模式：选择离子监测（SIM） o监测离子m/z99、171、327、342,定量离子m/z3270离子源：EI源。离子源温度：230CoEI源轰击能：70eV36. 4. 5. 2 测定定性方法：衍生后试样溶液峰与三聚氤胺标准品峰保留时间的相对偏差不大于0.

22、5%,且四个监测 离子丰度比与标准溶液的四个监测离子丰度比一致（即相差在20%以内），可判断试样中含有三聚氤胺。定量方法：取衍生后的标准工作液及试样溶液，以m/z327碎片离子色谱峰（基峰）面积积分值进行 单点或多点校准。6. 4.6空白试验除不加试料外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。6.5结果计算与表述试料中三聚氤胺的残留量按式（3）计算：AxCxVxPxlOOOX= （3）A; xMxlOOO式中：X试料中三聚氤胺的残留量，单位为亳克每千克（mg/kg）；C标准工作液中三聚氤胺的上机浓度，单位为微克每亳升（pg/mL）:A试样溶液中经衍生化三聚氤胺337碎片离子的峰面积；As标准工作

23、液中经衍生化三聚氤胺327碎片离子的峰面枳；M供试试样质量，单位为克（g）；V试样溶液最终定容体积，单位为毫升（mL）；P稀释倍数。注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。6.6方法灵敏度、准确度、精密度6. 6. 1灵敏度三聚氤胺在猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉中的定量限为O.lOmg/kgo6. 6.2准确度本方法在0.20mg/kgl.OOmg/kg添加浓度的回收率为70%110%。6. 6.3精密度本方法的批内变异系数10%,批间变异系数15%o三聚氤胺标准品衍生物选择离子色谱图及对应质谱图、三聚林胺空白衍生物选择离子色谱图及质谱 图、三聚氤胺添加衍生物

24、选择离子色谱图及质谱图、三聚氤胺标准溶液衍生物全扫描质谱图见附录A中 图A410。附录A（资料性附录）AbundanceTIC: a-012.D11000001000000900000800000700000600000500000400000300000200000100000Timer图A.4三聚氟胺标准品1. Q38ug/jnl衍生物选择离子色谱图 保留时间6. 85ninAbundance450000Scan 279 (6.853 min): Ml 2D327400000350000300000342250000200000171150000:100000:99500000m/z- I I II I I II I I I I I I I II I I I II I I I I I I I I II I I I II I I I I I I I II I I I I I I I I I I I I 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340图A. 5三聚氤胺标准品L 038ug/ml衍生物送择离子质谱图定性离子:m/z99.327、342AbundanceTime-图A. 6三聚氤腹空白衍生物选择离子色谱图Abundan