人工老化处理对大麦种子萌发早期淀粉及淀粉酶活性的影响

1、基金项目：农业部现代农业产业技术体系建设（项目编号：CARS-05）；石河子大学科学技术研究发展计划“动植物育种专项计划”（gxjs2015-yz02）收稿日期：2016-5-31 作者简介：王凤，女，1991年4月出生，硕士，大麦种子生理通讯作者：齐军仓，男，1971年11月出生，教授，大麦遗传育种与栽培技术人工老化处理对大麦种子萌发早期淀粉及淀粉酶活性的影响王凤 齐军仓 郭亚南 郑许光 龚磊 王少玉 陈阿龙 黄湘怡 李忠豪 宋瑞娇（石河子大学农学院，石河子 832003）摘要：采用高温高湿人工老化处理的方法，探究老化处理对大麦种子淀粉粒及萌发早期淀粉含量和淀粉酶活性的影响。研究表明：人工老

2、化处理未改变大麦种子胚乳淀粉粒的基本形态特征，但使萌发72 h的种子胚乳中小淀粉粒逐渐增加，大淀粉粒逐渐减少，且大淀粉粒表面赤道凹槽和小孔明显减少；随着老化时间的延长，大麦种子内支链淀粉和直链淀粉的含量均呈增加的趋势，-淀粉酶、-淀粉酶和极限糊精酶活性均呈降低的趋势，且老化15 d与对照相比，淀粉含量和淀粉酶活性差异均达到显著水平。老化使淀粉酶活性降低，淀粉粒酶解减缓，从而导致大麦种子萌发早期淀粉的分解受到抑制。关键词：大麦 人工老化 萌发早期 淀粉分解中图分类号：S512.1；S311 文献标识码 ：A 文章编号：20160288Effect of Aging on Starch and A

3、mylase Activity of Barley Seeds in Early Germination Wang Feng Qi Juncang Guo Yanan Zheng Xuguang Gong Lei Wang Shaoyu Chen Along Huang Xiangyi Li Zhonghao Song Ruijiao(College of Agriculture, Shihezi University, Shihezi 832003)Abstract: This study was to explore the effect of aging on starch granul

4、e, starch content and amylase activity of barley seeds with high temperature and high humidity artificial aging treatment in the early stage of germination. The results showed that artificial aging had no effect on barley endosperm starch granule on the basis of morphological characteristics. Howeve

5、r, it increased the small starch granules and reduced large starch granules of endosperm. Besides, the equatorial grooves and pin holes at the surfaces of the large starch granules decreased significantly in the germination 72 h. In addition, artificial aging induced the increasing of amylopectin an

6、d amylose content and reduced the activity of -amylase and -amylase. There were significant differences in starch content and amylase activity of all barley between the aging 15 d and control. Conclusion: aging reduced amylase activity and the degradation of the starch was mitigated consequently, wh

7、ich resulted in the inhibition of starch mobilization of barley seed in the early stage germination.Keywords: barley, artificial aging, early germination, starch depolymerization种子老化不仅影响其萌发和幼苗生长，也会影响植株后期的生长、产量及籽粒品质。目前，研究发现老化会影响种子内可溶性糖、蛋白质等贮藏物质含量的变化1-2。大麦作为啤酒生产的主要原料，淀粉是其主要的贮藏物质，约占种子干重的64%左右，其中包括30%左右

8、的直链淀粉和70%左右的支链淀粉。淀粉在大麦胚乳中以淀粉粒的形式存在，且大小差别较大，Kang等3将大麦淀粉粒分为大、小2种类型，而Takeda等4将大麦淀粉粒分为A、B和C（即大、中和小）3种类型，但由于B和C型淀粉粒大小差别较小，且二者的发生发育相似，故在观察结构时很难将B、C型淀粉粒明显区分开5。目前，麦类种子淀粉和胚乳淀粉粒的超微结构研究集中在种子发育的早期6-9，但是老化处理对大麦种子萌发过程中的淀粉及其超微结构研究鲜见报道。大麦种子淀粉的降解以淀粉酶水解途径为主，淀粉磷酸化途径为辅。其中，淀粉水解途径的降解需要-淀粉酶（EC ）、-淀粉酶（EC ）、极限糊精酶（EC 1）等的共同作

9、用10。-淀粉酶是内切型淀粉酶，也是淀粉水解的起始酶，分解直链淀粉生成麦芽糖和麦芽三糖，而分解支链淀粉则生成麦芽糖、麦芽三糖和-糊精，大麦种子萌发过程中-淀粉酶活性呈增加的趋势11-12。-淀粉酶是外切淀粉酶，不能分解支链淀粉的分支点，淀粉经-淀粉酶分解的产物是麦芽糖和-糊精，-淀粉酶活性水平在整个种子萌发过程中均要高于-淀粉酶活性13-14。但是，淀粉不能被-淀粉酶和-淀粉酶完全降解，必须有极限糊精酶的参与才能彻底降解为可发酵的糖。极限糊精酶具有高度的特异性，专门水解支链淀粉和分支糊精中的-1,6糖苷键，作用的产物是直链淀粉，在萌发过程中，极限糊精酶活性逐渐增强，但其含量远低于其它水解酶15

10、。然而，老化对于大麦种子淀粉分解过程中催化、调控其水解的一系列酶的研究鲜见报道。 本研究采用高温高湿人工加速老化法，对大麦种子进行老化处理，研究老化处理对大麦种子胚乳淀粉粒及萌发早期淀粉含量和淀粉酶活性的影响，以期揭示大麦种子老化劣变对淀粉代谢产生的影响。1 材料与试验方法1.1 试验材料选用2014年7月石河子大学试验站收获的春性二棱皮大麦甘啤4号、垦啤7号、P12-8和9810种子作为试验材料，种子收获后保存于15种子库36个月备用16。1.2 种子人工老化处理采用高温高湿法17，略作修改。将RP-250A型智能人工气候培养箱分5层，中间3层架子铺上尼龙网，预先将所有培养箱的内部、白瓷盘以

11、及尼龙网等用75%乙醇消毒。用40 cm30 cm白瓷盘盛满蒸馏水置于培养箱的最上层和最底层，将培养箱温度调至40，平衡1 d，待培养箱内的温湿度稳定在40、80%相对湿度。次日，分别将各品种种子单层平铺于培养箱中间3层，之后每隔0、3、6、9、12、15 d后取出种子并及时适量补水。最后，将老化处理后的种子置于室温下自然风干，待其含水量降至原始水平后进行相关试验。1.3 萌发处理及取样参照国际种子检验规程规定的大麦种子发芽条件，采用发芽盒纸上法。从干种子吸水12 h开始至发芽（72 h），每隔12 h取样1次，共取样6次，各3次重复。1.4 淀粉粒的提取 大麦胚乳淀粉粒的提取参照Peng等1

12、8的方法，并略作修改。随机选取萌发72 h的大麦种子50粒，剥去种胚、根和芽，在10 mL 蒸馏水中研磨。将混合物转入50 mL离心管，4 000 g离心5min。移去沉淀上部的黄色胶状物，过60目筛，并将沉淀悬浮在10 mL H2O中。将悬浮液平铺在15 mL 80% （w/v）的氯化铯水溶液上（氯化铯的体积是悬浮液体积的23倍），4 000 g离心5 min，移去上清液。重复2次上述氯化铯离心步骤。用10 mL漂洗缓冲液洗沉淀34次，再用水和丙酮漂洗沉淀各34次。常温干燥沉淀，将干燥的淀粉研磨成细粉，过100目筛，储存于-20备用。 1.5 淀粉粒的观察 淀粉粒类型的变化采用荧光显微镜（O

13、lympusBX51，Japan）观察19，淀粉粒表观特性采用扫描电镜（Hitachi S570，Japan）观察，加速电压315 KV。各处理3次重复，每个处理观察10个视野，取平均值。1.6 淀粉含量的测定淀粉含量采用双波长法测定20，略作修改。采用紫外分光光度计（Hitachi U-3900，Japan）测定淀粉提取液的吸光度值。确定直链淀粉测定波长1为554nm，参比波长2为490nm；支链淀粉测定波长3为542nm，参比波长4为713nm。各处理3次重复。1.7 淀粉酶活性的测定淀粉酶活性采用3,5-二硝基水杨酸测定还原糖的方法21。淀粉酶活力的定义为1 min由底物催化生成1 mg

14、还原糖的酶量为一个酶活力单位（U）。极限糊精酶提取22与测定根据爱尔兰Megazyme公司试剂使用说明，各处理3次重复。1.8 数据分析利用Excel进行数据处理，SPSS 18.0进行方差分析和相关性分析，SigmaPlot 10.0作图。2 结果与分析2.1 人工老化对大麦种子胚乳淀粉粒的影响 2.1.1 人工老化对大麦种子胚乳淀粉粒类型的影响表1 不同活力水平的大麦种子萌发早期胚乳淀粉粒的类型（n=30）品种老化时间/d淀粉粒类型品种老化时间/d淀粉粒类型大淀粉粒（直径10 m）/个小淀粉粒（直径10 m）/个大淀粉粒（直径10 m）/个小淀粉粒（直径10 m）/个甘啤4号048.672

15、.06 a29.332.52 c垦啤7号048.332.51 a39.002.65 c345.671.53 a33.671.53 c351.332.08 a42.001.50 c944.002.00 a52.672.52 b951.002.36 a89.332.06 b1540.672.06 b115.003.57 a1540.672.13 b150.333.48 aP12-8049.672.08 a22.331.06 c9810048.502.79 a24.002.00 d343.332.06 b26.672.08 c345.672.51 a39.332.39 c941.672.53 b64

16、.332.15 b938.331.53 b66.332.16 b1534.672.02 c123.673.51 a1530.332.51 c107.333.64 a注：不同小写字母表示不同老化天数下差异达显著水平（P0.05），本研究采用Kang等3的方法，将淀粉粒分为大、小两类，即将B和C型统称为小淀粉粒，A型称为大淀粉粒。不同品种大麦对照种子在萌发72 h时，胚乳存在大和小2种类型的淀粉粒，且以大淀粉粒为主，小淀粉粒较少。但是随着老化时间的延长，各品种种子胚乳中小淀粉粒逐渐增加，大淀粉粒逐渐减少。经统计分析，老化15 d甘啤4号、垦啤7号、P12-8和9810种子胚乳大淀粉粒与对照相比减少

17、了16.44%、15.85%、30.20%和37.46%，差异达到显著水平；老化15 d甘啤4号、垦啤7号、P12-8和9810种子胚乳小淀粉粒与对照相比增加了292.09%、285.46%、453.83%和347.21%，差异达到显著水平（表1）。2.1.2 人工老化对大麦种子胚乳淀粉粒表观特性的影响由图1可知，所有处理的大麦种子胚乳的基本形态无明显差异，大淀粉粒为盘状，小淀粉粒为球状。未经老化的甘啤4号种子胚乳大淀粉粒赤道出现凹槽和小孔，并被水解成大小不同的空洞，而垦啤7号、P12-8和9810种子胚乳大淀粉粒出现了较明显的赤道凹槽和小孔。随着老化时间延长，各品种的种子胚乳淀粉粒赤道凹槽和

18、小孔明显减少，老化15 d后，各品种大麦种子胚乳淀粉粒表面则较光滑。注：A为甘啤4号，B为垦啤7号，C为P12-8 D为9810；1为CK，2为老化3 d，3为老化9 d，4为老化15 d；箭头所指为淀粉粒表面的赤道凹槽和微孔。 图1 人工老化处理对大麦种子萌发72 h胚乳淀粉粒表观特性的影响（1 000）2.2 老化对萌发早期大麦种子淀粉质量分数的影响2.2.1 老化对萌发早期大麦种子支链淀粉质量分数的影响由图2可知，4个品种各处理种子萌发12 h时，支链淀粉质量分数差异无统计学意义。随着老化时间的延长，各品种种子内支链淀粉质量分数与对照相比分别逐渐增加。老化15 d，萌发72 h时的甘啤4

19、号、垦啤7号、P12-8、9810种子内支链淀粉质量分数与对照相比分别增加了9.93%、18.01%、20.21%和21.98%，差异达到显著水平，而且萌发72 h时，垦啤7号老化处理间（除12 d与15 d）差异均达到显著水平。萌发4872 h时，甘啤4号种子内支链淀粉分解较其它3个品种更少。注：A为甘啤4号，B为垦啤7号，C为P12-8，D为9810；不同颜色的柱形从左到右依次为CK，老化3 d，老化6 d，老化9 d，老化12 d，老化15 d；不同小写字母表示不同老化天数下差异达显著水平（P0.05）。下同。图2 老化对萌发早期大麦种子支链淀粉质量分数的影响2.2.2 老化对萌发早期大

20、麦种子直链淀粉质量分数的影响由图3可知，垦啤7号各老化处理种子在萌发1224 h时，直链淀粉质量分数与对照相比差异无统计学意义。随着老化时间延长，各品种种子内直链淀粉质量分数与对照相比分别逐渐增加。老化15 d，萌发72 h时的甘啤4号、垦啤7号、P12-8和9810种子内直链淀粉质量分数与对照相比分别增加了28.88%、15.38%、16.08%和30.89%，差异达到显著水平。老化15 d的P12-8种子在萌发4872 h，其支链淀粉分解较其它3个品种更少。图3 老化对萌发早期大麦种子直链淀粉质量分数的影响2.3 老化对萌发早期大麦种子淀粉酶活性的影响2.3.1 老化对萌发早期大麦种子-淀

21、粉酶活性的影响由图4可知，随着老化程度的加深，-淀粉酶活性逐渐降低。老化15 d的垦啤7号种子在萌发12 h时未检测到-淀粉酶活性，甘啤4号、垦啤7号、P12-8和9810种子内检测到了少量低活力值的-淀粉酶，各老化处理与对照相比差异无统计学意义。不同老化水平的甘啤4号种子在萌发24 h时，-淀粉酶活性与对照相比差异达到显著水平，且不同老化处理间差异达到显著水平。老化15 d的甘啤4号、垦啤7号、P12-8和9810种子在萌发72 h时，种子内-淀粉酶活性与对照相比分别降低了58.39%、44.11%、48.68%和49.96%，差异达到显著水平。图4人工老化对萌发早期大麦种子-淀粉酶活性的影

22、响2.3.2 老化对萌发早期大麦种子-淀粉酶活性的影响由图5可知，随着老化程度的加深，-淀粉酶活性逐渐降低。4个品种各处理的种子在萌发12 h时，均检测到了低活力值的-淀粉酶。各品种老化9 d的种子在萌发在萌发2472 h时，-淀粉酶活性显著低于对照。老化15 d的甘啤4号、垦啤7号、P12-8和9810种子在萌发72 h时，-淀粉酶活性与对照相比分别降低了50.99%、37.40%、58.52%和53.77%，差异达到显著水平。图5 人工老化对萌发早期大麦种子-淀粉酶活性的影响2.3.3 老化对萌发早期大麦种子极限糊精酶活性的影响由图6可知，随着老化程度的加深，极限糊精酶活性逐渐降低。老化1

23、5 d，萌发12 h的甘啤4号和垦啤7号种子内极限糊精酶活性与对照相比，差异达到显著水平，而P12-8和9810种子内极限糊精酶活性与对照相比，无显著差异。萌发1236 h，4个品种种子内极限糊精酶活性缓慢增加，萌发36 h以后，甘啤4号和垦啤7号种子内极限糊精酶活性迅速增加，而萌发48 h以后，甘啤4号和垦啤7号种子内极限糊精酶活性迅速增加。老化15 d，萌发72 h时的甘啤4号、垦啤7号、P12-8和9810种子内极限糊精酶活性与对照相比分别降低了77.52%、70.33%、82.59%和68.60%，差异达到显著水平。图6 人工老化对萌发早期大麦种子极限糊精酶活性的影响3 讨论3.1 人

24、工老化对淀粉的影响种子吸水后，其糊粉层和盾片上皮层会合成一系列水解酶，这些酶分泌到淀粉胚乳中，分解细胞壁与贮藏的淀粉23。萌发过程中，胚乳淀粉粒的直径逐渐变小，其表面赤道凹槽和小孔部分更易被酶解，总淀粉粒的酶解效率和大淀粉粒含量呈正相关24。本研究发现，未经老化处理的各品种大麦种子在萌发72 h时，胚乳均有大、小淀粉粒，且以大淀粉粒为主，大淀粉粒较少。但是随着老化程度加深，各品种种子胚乳中小淀粉粒逐渐增加，大淀粉粒逐渐减少，说明，老化处理会导致大麦种子胚乳大、小淀粉粒的数目发生变化。同时，还发现老化处理后大淀粉粒为盘状，小淀粉粒为球状，这与银永安等25和韦存虚等6报道的结果相似。但是，随着老化

25、时间延长，种子胚乳大淀粉粒赤道凹槽和小孔明显减少，老化15 d后，各品种大麦种子胚乳淀粉粒表面则较光滑，由此表明，老化处理未改变大麦胚乳淀粉粒的基本形态特征，但对其表观特性有一定影响。此外，本研究发现同一萌发时间，老化程度越深，4个品种种子内支链淀粉和直链淀粉的质量分数均增加的趋势，这与蔡秋华等26在水稻上研究相似。究其原因，可能是随着老化程度的加深，淀粉酶的合成或释放过程受到影响，使淀粉酶的活性受到抑制，从而导致胚乳淀粉粒分解延缓，支链淀粉和直链淀粉的质量分数增加。3.2 人工老化对淀粉酶的影响-淀粉酶、-淀粉酶和极限糊精酶的活性在萌发大麦种子中均呈增加趋势16，而老化会引起种子内酶活力改变

26、。本研究发现，在相同萌发时间，老化处理后的大麦种子中-淀粉酶的酶活性呈降低的趋势。这可能是由于随着老化程度的加深，大麦种子糊粉层中-淀粉酶的合成过程受到影响，或是糊粉层细胞壁释放-淀粉酶的过程受到了抑制27。其次，研究发现老化程度越深，-淀粉酶的酶活性呈降低的趋势，而且将-淀粉酶与-淀粉酶活性变化趋势进行比较，-淀粉酶活性降低的趋势更明显。这可能是自由态-淀粉酶发生了部分降解或失活28，或是蛋白酶介导的种子萌发束缚态-淀粉酶的释放过程受阻29。此外，随着老化程度的加深，极限糊精酶的活性呈降低的趋势，该酶主要作用是水解被-淀粉酶和-淀粉酶联合降解淀粉后形成的较小的分支寡糖，其活性可能受-淀粉酶和

27、-淀粉酶活性的降低的影响。还有大麦种子在萌发过程中合成的极限糊精酶与种子中的不可溶性物质结合形成无活性的形式，而成熟种子胚和胚乳中存在含量较高的极限糊精酶抑制因子30，老化可能促使抑制因子的增加从而抑制了极限糊精酶的活性。4结论 人工老化降低了淀粉酶活性，淀粉粒降解延缓，从而导致大麦种子萌发早期淀粉的分解受到抑制。本文仅研究了老化处理对大麦种子淀粉分解的生理生化变化，对引起淀粉酶活性变化内在原因还有待进一步研究。参考文献1 孔治有, 刘叶菊, 覃鹏. 人工加速老化对小麦种子CAT、POD、SOD活性和可溶性蛋白质含量的影响J. 中国粮油学报, 2010, 25(10): 24-27Kong Z

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