微生物的接种和分离技术应用

1、微生物的接种和分离技术应用实验内容实验目的实验原理操作步骤注意事项问题与思考实验目的 1.了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。2.了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。3.熟悉分离、培养微生物前的有关准备工作及操作方法。二 实验原理培养基是人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质原则：目的明确 ;营养协调;控制PH、渗透压等条件;经济节约方法：查阅文献;精心设计;试验比较 步骤：计算、称量、溶解、调PH、加琼脂、熔化、过滤、 分装、加塞、包扎、灭菌、冷却、无菌检查 营养六要素碳源：提供微生物繁殖所需碳元素的营养物质。用途：糖、蛋白质、核酸合成

2、。氮源：提供微生物繁殖所需氮元素的营养物质。用途：蛋白质、核酸合成。能源：提供微生物生命活动最初能量来源的营养物或辐射能。生长素：微生物生长必需，但又不能自行合成的有机物。无机盐：提供微生物繁殖所需各种重要元素。水分：水是保证生命活动重要的介质。培养基种类:一、按成份的不同划分 天然培养基、合成培养基、半合成培养基二、按培养基的物理状态划分 固体培养基、液体培养基、半固体培养基三、按培养基用途划分 基础培养基、加富培养基、鉴别培养基、选择培养基 培养基的种类据组成成分可分为: 1. 合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。（如葡萄糖铵盐培养基、淀粉硝酸盐培养基等。） 2. 半合成培养基

3、：有一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制而成。（如马铃薯蔗糖培养基。） 3. 天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成。 （如牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基等。） 1. 液体培养基：不加凝固剂（常用凝固剂为琼脂）的液体状态培养基。 2. 固体培养基：在液体培养基中加入2%左右的凝固剂的固体状态的培养基。 3. 半固体培养基：在液体培养基中加入0.2-0.7%凝固剂而成的半固体状培养基。从培养基的物理状态可分为按照培养基的用途，可将其分为：加富培养基：加富培养基是指在普通培养基里加过血、血清、动物（或植物）组织液或其他营养物质（或生长因子）的一类营养丰富的培养基，用以培养某种或某类营养要求苛

4、刻的异养微生物选择培养基：选择培养基是根据某种或某一类群微生物的特殊营养需要或对某种化合物的敏感性不同而设计出来的一类培养基。利用这种培养基可以将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来。鉴别培养基：普通培养基中加入能与某种代谢产物发生反应的指示剂或化学药品，从而产生某种明显的特征性变化，以区别不同的微生物。牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。其配方如下：牛肉膏3g，蛋白胨10g，Nacl5g，琼脂1520g，水1000mL，7.2(后调)高氏1号培养基高氏1号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基。其配方如下：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，

5、K2HPO4，MgSO4，FeSO4，琼脂1520g，水1000mL，。 查氏合成培养基查氏合成培养基是用来分类和培养霉菌的培养基,其配方如下：NaNO3 3g,K2HPO4 1g, KCl 0.5g, MgSO4.7H2O 0.5g,FeSO4 0.01g,蔗糖 30g, H2O 1000ml,pH自然麦芽汁培养基用来培养酵母菌,干麦芽粉加4倍水,在50-60保温糖化3-4小时，用碘液试验检查至糖化完全为止,调整糖液浓度,煮沸后，过滤，调pH为。培养基配制程序9. 加塞10. 包扎11. 灭菌12. 搁置斜面、倒平板13. 无菌检查计算称量溶解调pH加琼脂融化过滤分装消毒与灭菌消毒：消灭病原

6、菌和有害微生物的营养体灭菌：杀灭一切微生物的营养体，芽胞和孢子。方法：物理的方法：加热、过滤、辐射化学的方法：用化学试剂抑制或杀灭微生物。主要破坏细菌代谢机能。如重金属离子，磺胺类药物及抗生素等。 一、概念：（一）清洁（cleaning)：是指用物理方法清除物体表面的污垢、尘埃和有机物.目的: 去除和减少微生物，但并非杀灭微生物。 （二）消毒(disinfection)： 用物理或化学的方法清除或杀灭除芽胞以外的所有病原微生物，使其数量减少到无害程度的过程。 （三）灭菌(sterilization)： 用物理或化学方法杀灭全部微生物，包括致病和非致病的微生物，以及细菌的芽胞的过程。 二、消毒灭

7、菌的方法消毒灭菌方法有两大类：物理消毒灭菌法和化学消毒灭菌法消毒灭菌方法物理消毒灭菌法化学消毒灭菌法热力消毒灭菌光照消毒法微波消毒灭菌浸泡法喷雾法擦拭法熏蒸法干热湿热燃烧法干烤法煮沸消毒法压力蒸汽灭菌 手提式压力蒸汽灭菌器卧式压力蒸汽灭菌器 预真空压力蒸汽灭菌器日光曝晒紫外线灯管消毒电离辐射灭菌法 臭氧灭菌灯灭菌注：每一种消毒灭菌的方法、特点、适用物品、注意事项都是掌握的重点。过滤除菌干热法：火焰灼烧灭菌和热空气灭菌1、火焰灼烧适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，试管口和瓶口，涂布用玻璃棒。2、热空气灭菌利用高温干燥空气（160170C）加热灭菌12h，适用于玻璃器皿和培养皿等。原理加热使

8、蛋白质变性，与水的含量有关，当环境和细胞含水量越大，凝固越快。3、注意事项： 1）培养基、橡胶制品、塑料制品不能用此法； 2）温度控制在180； 3）物品不能太挤； 4）温度降至70时才开箱门。 1、热力消毒灭菌法-干热法烤箱对物品的要求：高温下不变质，不损坏、不蒸发的物品，如油剂、金属制品、玻璃器具等。加热灭菌湿热灭菌 高压蒸气灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，得到高于100的温度。导致菌体蛋白质凝固变性

9、而达到灭菌的目的。 在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低，二是湿热的穿透力比干热大，三是湿热的蒸气有潜热存在。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。1g水在100时，由气态变为液态时可放出2.26kJ(千焦)的热量。1）手提式压力蒸汽灭菌器： 压力：103kPa，时间：15-30分钟，温度：121126手提式压力蒸汽灭菌器立式或卧式灭菌锅。容量较大，一般能装几十瓶或几百瓶。2、光照消毒法又称辐射消毒，主要利用紫外线的杀菌作用，使菌体蛋白光解、变性而导致细菌死亡。（1）日光暴晒法（2）

10、紫外线灯管消毒法2、光照消毒法（1）日光暴晒法 日光有热、干燥和紫外线的作用，有一定杀菌力 常用于：床垫、毛毯、衣服、书籍等物品的消毒 方法：是将物品放在直射阳光下暴晒6h，定时翻动，使物品各面均能受到日光照射，达到消毒的目的2、光照消毒法(2)紫外线灯管消毒法紫外线属电磁波辐射，根据波长可分为A波、B波、C波和真空紫外线。消毒使用的是C波紫外线，其波长范围为200 nm275nm，杀菌作用最强的波段为250 nm 270nm。紫外线可杀灭多种微生物，包括杆菌、病毒、真菌、细菌繁殖体、芽孢等。常用的紫外线灯管 15W、20W、30W、40W紫外线灯管：2、光照消毒法(2)紫外线灯管消毒法1）作

11、用机制 1、破坏菌体蛋白质中的氨基酸，使菌体蛋白 光解变性； 2、使菌体DNA失去转化能力而死亡； 3、降低菌体内氧化酶的活性，使氧化能力丧失 4、使空气中的氧电离产生极强杀菌作用的臭氧2、光照消毒法(2)紫外线灯管消毒法2）使用方法1、空气消毒：消毒前做好室内清洁卫生工作（紫外线易被灰尘微粒吸收而影响效果），关闭门窗，人员停止走动，每10m2安装30W紫外线灯管一支，有效距离不超过2m，照射时间为3060分钟；2、物品消毒：消毒时应将物品摊开或挂起以减少遮挡（紫外线穿透力差），有效距离为2560cm，照射时间为2030分钟。3、液体消毒：可采用水内照射法或水外照射法，水层厚度应小于2cm,并

12、根据紫外线的辐照强度确定水流速度。2、光照消毒法(2)紫外线灯管消毒法3）注意事项3、由于紫外线的穿透力差，消毒物品时应将物品摊开或挂起，并定时翻动，使其表面受到直接照射；4、紫外线消毒的适宜温度为2040，适宜湿度为4060；5、紫外线的消毒时间须从灯亮57min后开始计时，照射后病室要通风换气。关灯后如需再开启，应间歇34min。普通移动紫外线灯消毒车C波段移动紫外线灯消毒车家用紫外消毒线灯3）臭氧灭菌消毒臭氧灭菌灯臭氧发生器2、光照消毒法（3）臭氧灭菌消毒法 臭氧在常温下为强氧化剂，稳定性极差，易爆炸，主要依靠强大的氧化作用杀菌，可杀灭细菌繁殖体、病毒、芽孢、真菌，并可破坏肉毒杆菌毒素。

13、（补充） 灭菌灯内装有臭氧发生管，在电场作用下，可将空气中的氧气转换成高纯臭氧。主要用于空气、物品表面等的消毒。方法：关闭门窗，人员离开，打开开关20分钟，（杀灭芽孢40分钟）。消毒后30分钟，人方可进入。 2、光照消毒法（3）臭氧灭菌灯消毒法注意事项1、为保证消毒效果，使用时需关闭门窗；2、臭氧对人有毒，国家规定大气中允许浓度为 02mg/m3；3、由于臭氧的强氧化性，对多种物品都有损坏；4、温湿度、有机物、pH等多种因素可影响臭氧的 杀菌作用；5、空气消毒时，人员必须离开，待消毒结束后 30min可进入。 3、微波消毒灭菌法 微波是一种频率高、波长短的电磁波。在电磁波的高频交流电场中，物品

14、中的极性分子发生极化，高速运动，并频繁改变方向，互相摩擦、碰撞，使温度迅速上升，达到消毒灭菌的作用。 微波可以杀灭各种微生物，包括细菌繁殖体、真菌、病毒和细菌芽孢、真菌孢子等。常用于食物及餐具的消毒、化验单据及票证的消毒、医疗药品及耐热的非金属材料器械的消毒灭菌。 4、电离辐射灭菌法 利用放射性核素60Co发射高能射线（丙种射线）或电子加速器产生的高能电子束（阴极射线）进行辐射灭菌，杀死微生物的灭菌法。由于此法是在常温下灭菌，故又称“冷灭菌”，适用于不耐高温物品的灭菌，如：金属、橡胶、塑料、高分子聚合物（如一次性注射器、输液器、输血器等）、精密医疗器械、生物医学制品等均可用此法灭菌。因放射线对

15、人体有害，应选用机械传递物品。5、过滤除菌 过滤除菌法（filtration） 是用物理阻留的方法将液体或空气的细菌除去，以达到无菌目的。所用的器具是含有微小孔径的滤菌器（filter）。主要用于血清、毒素、抗生素等不耐热生物制品及空气的除菌。常用的滤菌器有薄膜滤菌器（和孔径）、陶瓷滤菌器、石棉滤菌器（即Seitz滤菌器）、烧结玻璃滤菌器等。 利用滤膜过滤去除细菌的方法。常用的有熔结玻璃细菌滤器、火棉胶、硝化纤维素滤膜等。用最大孔径不超过1nm的过滤器可得到无菌滤液，常用于对热不稳定的物质的除菌。空气或其他气体也可通过棉花或超细纤维膜达到除菌的目的。 过滤除菌 不能用加热灭菌的液体物质（如维生

16、素、血清），一般可用细菌过滤器进行除菌。（二）化学消毒灭菌法定义： 利用液体或气体的化学药物抑制微生物的生长繁殖或杀灭微生物的方法。 凡不适用热力消毒灭菌的物品，都可采用化学消毒灭菌法。如病人皮肤、黏膜、排泄物及周围环境、光学仪器、金属锐器和某些塑料制品的消毒。（二）化学消毒灭菌法1、化学消毒剂的作用原理（1）与菌体蛋白质的氨基结合，使蛋白质变性、酶活性消失。如甲醛、碘酊（2）与菌体蛋白的巯基、氨基结合，使蛋白质变性。如戊二醛（3）通过对菌体蛋白质分子的烷基化作用，干扰酶的正常代谢而杀灭微生物，如环氧乙烷（4）抑制细菌酶活性，破坏细胞代谢导致菌体死亡，如漂白粉（5）使菌体蛋白凝固变性。如707

17、5的乙醇（6）破坏细胞膜的酶活性，使胞浆膜破裂，如氯乙定（二）化学消毒灭菌法2、化学消毒剂的分类（1）灭菌剂：可以杀灭一切微生物，包括细菌芽孢，使其达到灭菌效果的制剂。如甲醛、戊二醛、过氧乙酸、环氧乙烷等（2）高效消毒剂：指可杀灭一切细菌繁殖体、病毒、真菌及其孢子，并对细菌芽孢有显著杀灭作用的制剂，如含氯消毒剂、过氧化氢等 （3）中效消毒剂：能杀灭细菌芽孢以外的细菌繁殖体、真菌、病毒及其他微生物的制剂。如乙醇、碘消毒剂（4）低效消毒剂：只能杀灭细菌繁殖体，亲脂病毒和某些真菌的制剂，如氯乙定等。细菌培养技术 内容常用细菌培养方法。细菌的分离培养和接种技术。细菌生长现象观察。 一、常用细菌培养方法

18、需氧培养法（一般培养）适用于需氧菌和兼性厌氧菌培养。培养温度：37（采用恒温培养箱）。培养时间：1824h。二氧化碳培养法适用于奈瑟菌属和布鲁菌属等苛养菌培养。可采用烛缸法、二氧化碳培养箱。一、常用细菌培养方法微需氧培养法适用于空肠弯曲菌、幽门螺杆菌等微需氧菌培养。可采用抽气换气法。厌氧培养法适用于专性厌氧菌培养。厌氧培养箱、厌氧袋、厌氧罐、疱肉培养法、硫乙醇酸盐法等。二、细菌的分离培养和接种技术(一)接种工具接种针和接种环：由三部分组组成，即环（针）、金属柄和绝缘柄。接种前后都要过火灭菌。接种针用于穿刺接种细菌，接种环用于固体、液体培养基的细菌接种。L型玻璃棒：用于琼脂平板涂布接种细菌。（二

19、）接种环境操作需在接种罩、超净工作台或无菌室内进行。常用的接种工具在实验室或生产实践中，用得最多的接种工具是接种环、接种针。有时滴管、吸管也可作为接种工具进行液体接种。在固体培养基表面要将菌液均匀涂布时，需要用到涂布棒。3、常用的接种方法划线接种：液体接种穿刺接种涂布接种三点接种浇混接种注射接种最常用的接种方法。即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可达到接种的作用。在斜面接种和平板划线中就常用此法。3、常用的接种方法划线接种液体接种:穿刺接种涂布接种三点接种浇混接种注射接种从固体培养基上挑取细菌，接种到液体培养基中；或者从液体培养物中将菌液接至液体培养基中，称为液体接种。3、常用的接种方法

20、划线接种液体接种穿刺接种：涂布接种三点接种浇混接种注射接种用接种针挑取少量的细菌，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺。在保藏厌氧菌种或研究细菌的动力时常采用此法。3、常用的接种方法划线接种液体接种穿刺接种涂布接种：三点接种浇混接种注射接种将菌液倒到平板上，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，让菌液均匀分布。3、常用的接种方法划线接种液体接种穿刺接种涂布接种三点接种：浇混接种注射接种把少量的微生物接种在平板表面上，成三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。常用于研究霉菌的形态。3、常用的接种方法划线接种液体接种穿刺接种涂布接种三点接种浇混接种：注射接种将待接的微生物做适当稀

21、释后，先放入培养皿中；然后再倒入冷却至45左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀；待平板凝固之后，置合适温度下培养.3、常用的接种方法划线接种液体接种穿刺接种涂布接种三点接种浇混接种注射接种：用注射的方法将待接的微生物转接至活的动物体内。可以是整个动物；也可是发育的鸡胚.（三）细菌接种的基本程序灭菌接种环沾取标本接种灭菌接种环杀灭接种环沾染的细菌，以免污染标本杀灭接种环沾染的细菌，以免污染环境细菌接种的基本程序取菌种试管和待接种的斜面试管灭菌接种环沾取标本接种接种后灭菌接种环（四）接种方法1.平板划线接种法：目的：使混合的细菌呈单个分散生长，形成单个菌落，以便获得纯菌。方法：分区划线法：适用于含菌量较

22、多的标本。连续划线法：适用于含菌量较少的标本。分区划线法第一区划线灭菌接种环第二区划线灭菌接种环第三区划线灭菌接种环连续划线法（四）接种方法2.液体培养基接种法可观察细菌在培养基中的生长现象或用作生化反应实验。 （四）接种方法3.半固体培养基接种法：穿刺接种法 ，用于保存菌种或观察细菌动力。11（四）接种方法4.斜面接种法：用于鉴定和保存菌种。 （四）接种方法5.涂布接种法：用于测定标本中活菌数和药敏实验细菌接种。 （四）接种方法6.倾注培养法：用于细菌计数。将上述已接种细菌的培养基置37恒温培养箱中孵育1824h，观察细菌的生长现象。三、细菌在培养基上的生长现象1、细菌在固体培养基中的生长现

23、象菌落定义：指单个细菌在平板培养基上生长繁殖，形成单一肉眼可见的细菌集团。菌落特征：大小、形状、边缘、颜色、表面、透明度、湿润度、黏度、溶血性。菌苔：指多个菌落融合在一起形成的细菌堆积物。菌落与菌苔菌落菌苔2、细菌在液体培养基中的生长现象混浊沉淀：多见于链状排列的细菌。菌膜：多见于厌氧菌。细菌在液体培养基中的生长现象菌膜菌沉淀均匀浑浊对照3、细菌在半固体培养基中的生长现象有鞭毛细菌：在培养基中沿穿刺线并向外扩散生长，穿刺线边缘模糊。无鞭毛细菌：只沿穿刺线生长，穿刺线边缘清晰。细菌在半固体培养基中的生长现象有动力 现象无动力 现象实验操作培养基的配制1.配制液体培养基2.配制半固体培养基3.配制

24、固体培养基实验操作高压灭菌器的使用1.首先将内层锅取出,再向外层锅内加入适量的水,使水面与三角搁架相平为宜。 切勿忘记加水,同时水量不可过少,以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。 2.放回内层锅,并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤,以免防碍蒸气流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与锅壁接触,以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。3.加盖,并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内，再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓,使螺栓松紧一致,勿使漏气。 4.用电炉或煤气加热,并同时打开排气阀,使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后,关上排气阀,让锅内的温度随蒸气压力增加到逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时,控制热源,维持压力至所需时间。灭菌的主要因素是温度而不是压力。因此锅内冷空气必须完全排尽后,才能关上排气阀,维持所需压力。 实验操作高压灭菌器的使用5.灭菌所需时间到后,切断电源或关闭煤气,让灭菌锅内温度自然下降,当压力表的压力降至“0”时,打开排气阀,旋松螺栓,打开盖子,取出灭菌物品。6.将取出的灭菌培养基,需摆斜面的则摆成斜面,然后放入37温箱培养24h,经检查若无杂菌生长,即可待用。实验操作-平板制作及划线法放斜面倒平板分区划线浇混法接种实验操作-斜面接种和穿刺接种 固体斜面接种半固体穿刺接种液体接种注意事项-培养基