工业微生物菌种保藏技术(52)(1)ppt课件

1、第九节 工业微生物菌种保藏技术 在消费发酵中，具有高产有重要经济价值的某一等待代谢产物主才干的微生物菌种的保管和长期保藏，对于一胜利的工业发酵过程极为重要。一、理想的菌种保藏方法应具备的条件(1) 经长期保藏后菌种存活健在；(2)保证高产突变株不改动表型和基因型，特别是不改动初级代谢产物和次级代谢产物消费的高产才干。(3)菌种保藏的根本措施是低温、枯燥、真空。一、微生物菌种保藏在一定时间内使菌种不死、不变、不乱根本要求：根本方法：生活态休眠态培育基传代培育寄主传代培育冷冻枯燥斜面、平板液氮、低温冰箱沙土管、冷冻真空枯燥 由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的顺应性，因此，

2、在详细选择保藏方法时必需对被保藏菌株的特性、保藏物的运用特点及现有条件等进展综合思索。 对于一些比较重要的微生物菌株，那么要尽能够多的采用各种不同的手段进展保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。国际重要菌种保藏机构.中国菌种保藏单位.二、工业微生物菌种保藏技术 (1)超低温或在液氮中冷冻保藏；(2)冷冻枯燥或真空枯燥保藏； (3)转接培育或斜面传代保藏； (4)土壤或陶瓷珠等载体于燥保藏。菌种保藏方法 暂时保藏法 斜面传代法 穿刺法 长期保藏法 液体石蜡法 甘油管法 砂管保藏法 砂土管保藏法 滤纸片保藏法 冷冻枯燥保藏法 液氮冷冻法 .2.1 冷冻保藏 冷冻保藏为保藏微生物菌种的最简单而

3、有效的方法。经过冷冻，使微生物代谢活动停顿。普通而言，冷冻温度愈低，效果愈好。为了获得称心的冷冻结果，通常应在培育物中参与一定的冷冻维护剂。冷冻保藏时温度要求在-20以下，同时应仔细掌握好冷冻速度和解冻速变。冷冻深藏的缺陷之一是培育物运输较困难。冷冻保藏种类 一、普通冷冻保藏技术(-20)二、超低温冷冻保藏技术(-60一-80)三、液氮冷冻保藏技术 普通冷冻保藏技术(-20)将液体培育物或从琼脂斜面培育物收获的细胞分接到试管或指管肉，然后贮藏于一冰箱的冷藏室中，或于温度范围在-5-20的普通冰箱(-20)中。或者，将菌种培育在小的试管或培育瓶斜面上，待生长适度后，将试管或瓶口用橡胶塞严厉封好，

4、同上置于冰箱中保管。用此方法可以维持假设干微生物的活力12年。应留意的是经过一次解冻的菌株培育物不宜再用来保藏。保藏过程中应留意控制保藏温度，培育瓶或试管应严厉密封。这一方法虽简便易行，但不适宜多数微生物的长期保藏。二、超低温冷冻保藏技术(-60一-80)要求长期保藏的微生物菌种，普通都要求在-60以下进展保藏。在超低温冷藏柜中保藏菌种的普通方法是： 1离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞； 2用新颖培育基重新悬浮所收获的细胞； 3参与等体积的20甘油或10二甲亚砜； 4混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70超低温冰箱中保藏。 假设待保藏菌种生长在斜面上，那么可用含10甘油的新配制液体培育基

5、洗涤收获。超低温冰箱的冷冻速度普通控制在1-2min。假设干细菌和真菌菌种可经过此保藏方法保藏5年而活力不受影响。三、液氮冷冻保藏技术 (一)冷冻维护剂 在液氮冷冻保藏中，最常用的冷冻维护剂是二甲亚砜和甘油，最终运用浓度普通为甘油10、二甲亚砜5。所运用的甘油般用高压蒸汽灭菌，而二甲亚砜最好为过滤灭菌。 (二)液氮冷冻保藏微生物菌种的步骤 1待冷冻保藏菌种悬液的制备 (1)从生长斜面制备菌悬液：每一斜面参与5ml含10甘油的营养液体培育；用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌体细胞悬液；0.5lml分装玻璃安瓿或液氮冷藏公用塑料瓶。 (2)从浸没培育物制备菌悬液： 在浸没培育液中参与等体积20%无菌甘

6、油；悄然振荡混匀培育液，假设菌体絮凝较紧，那么需先用玻璃珠打散；0.5-lml分装玻璃安瓿或液氮冷藏公用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精喷灯封口；将一切封好的安瓿置于5冰箱中3min，以使细胞和悬浮培育基之间到达平衡。 2控速冷冻 (1)将安瓿或液氮瓶置于铝盒或布袋中，然后置于一较大的金属容器中；(2)将此金属容器置于控速冷冻机的冷冻室中；(3)以1-2/min的致冷速度降温，直到温度到达相对温度之上几度的细胞冻结点(通常为-30)；(4)补加一定量的液氮至系统中，使细胞在冻结点时尽能够快地发生相变；(5)细胞冻结后，将致冷速度降为1/min，直到温度达-50；(6)将安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-19

7、6)或 气相(-156)中保管。 假设无控速冷冻机，那么普通可将安瓿或液氮瓶置于一70冰箱中冷冻4h，然后迅速移入液氮罐中保管。(三)复苏 1从液氮罐中取出所需的安瓿，立刻置于冰浴中；2迅速将安瓿置于37-40水浴中，并悄然摇动以加速解；3用巴氏吸管将安瓿中储存培育物移接入含有2m1无菌液体培育基的试管中，用同一支吸管反复抽吸数次，然后取0.1-0.2ml (约4、8滴)转接入琼脂斜面上。2.2 冻干保藏 冷冻枯燥的根本方法：是经过在减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华，使培育物枯燥。此法是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一。冷冻枯燥过程中必需运用冷冻维护剂，目前国内常用脱脂乳和蔗糖，国

8、外尚有运用动物血清等的。 大部分微生物菌种可以在冻干形状下保藏10年之久而不丧失活力。而且经冻干后的菌株无需进展冷冻保藏，便于运输。培育物的冻干过程冷冻真空枯燥操作流程安培瓶配制维护剂灭菌菌种培育制备菌悬液分装安培瓶洗净烘干装标签加棉塞预冻真空枯燥测定水分熔封管口检查真空度包藏.(三)冻干菌种的保藏与再生1保藏：冷冻枯燥后的培育物在低于5下保藏。较低的保藏温度(-20-70)对于培育物的长期稳定更好。2复苏：(1)在超净任务台中用70酒精棉球擦洗安瓿，然后用砂轮在安瓿中锉一道沟。(2)用无菌纱布或无菌毛巾包好安瓿，然后用手掰开安瓿。(3)在安瓿中参与0.51ml营养液体培育基，渐渐旋转安瓿，使

9、冻干菌种复水。然后将此转接到一含有再生培育基的无菌试管中，或直接接种琼脂斜面或涂布平板。(4)在指管中冻干的菌种通常为絮粉状，可以将此直接振落入盛有l2ml液体培育基的试管中，悄然振荡5l0min，然后用此悬液接种适宜的再生培育基。2.3传代保藏将菌种定期在新颖琼脂培育基上传代，然后在一定的生长温度下生长和保管的传代保藏方法。可用于实验室中假设干菌种的保藏。此法最为简单和经济，且不要求任何特殊的设备。但此方法易发生培育基干枯、菌体自溶、基因突变。2.3 传代培育法实验原理：保藏的菌种经过斜面、穿刺或疱肉培育基用于 厌氧细菌培育好后，置4C冰箱中存放，定期 进展传代培育、再存放。 可用胶塞替代棉

10、塞或在斜面上覆盖一层无菌液体 石蜡来进一步延伸保管期。操作方法 1、斜面保藏法 将菌种转接在适宜固体斜面培育基上，待其充分生长后，用牛皮纸将棉塞部分包扎好棉塞换成胶塞效果更好，置4C冰箱中包藏。 保藏时间依微生物的种类而定。霉菌、放线菌及芽孢菌保管24个月移种一次，酵母菌间隔两个月，普通细菌一个月，假单胞菌两周传代一次。 此法优点是操作简单、运用方便，缺陷是保藏时间短、易被污染。2、液体石蜡保藏法 将无菌石蜡加在已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1CM为准，使菌种与空气隔绝。 将试管直立，置低温或室温下保管。 此法适用且效果较好。霉菌、放线菌、芽孢菌可保藏两年以上，酵母菌可保藏12年，普通

11、细菌也可保藏1年左右。3、穿刺保藏法 按穿刺接种方式培育菌种，菌种长好后用胶塞封严，置4冰箱存放。矿物油中浸没保藏将琼脂斜面或液体培育物浸入矿物油中于室温下保藏，此方法简便有效。可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏。特别对难于冷冻枯燥的丝状真菌和难以在固体培育基上构成孢子的担子菌等的保藏更为有效。浸没保藏的操作要点是首先让待保藏菌种在适宜的培育基上生长，然后注入经170下灭菌1-2h的矿物油，矿物油的用量以高出培育物1cm为宜。以液体石蜡作为保藏方法时，应对需保藏的菌株预先作实验。由于某些菌株在液体石蜡下生长还十清楚显，有些菌株如某些假丝酵母还会同化液体石蜡，也有的对液体石蜡保藏敏感。一切

12、这些菌株都不能用液体石蜡保藏。为了预防不测，普通保藏株23年也应做一次存活实验。2.4 载体法实验原理：使生长适宜的微生物吸附在一定的载体上进展枯燥。 常用的载体有土壤、砂土、硅胶、明胶、麸皮、磁珠和滤 纸片等。操作方法砂土管保藏法 1河砂处置 取河砂假设干参与盐酸10% ，加热煮沸30min除去有机机质。倒去盐酸溶液，用自来水冲洗至中性，最后一次用蒸镏水冲洗，烘干后用40目筛子过筛，弃去粗颗粒，备用。土壤处置 取非耕作层不含腐殖质的痩黄土或红土，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性。烘干后碾碎，用100目筛子过筛，粗颗粒部分丢掉。 (3)砂土混合 处置妥当的河砂与土壤按3：1的比例掺合(或根据需求

13、而用其他比例，甚至可全部作砂或土)均匀后，装入10 x100mm的小试管或安瓿管中，每管分装1g左右，塞上棉塞，进展灭菌(通常采用间歇灭菌2-3次)，最后烘干。2.4 基因工程菌的保藏由载体质粒等携带的外源DNA片段通常是遗传不稳定的、且很易丧失其外源质粒复制子。质粒基因通常为宿主细胞生长非必需。普通情况下当细胞丧失这些质粒时，生长速度会加快。当培育基中参与抗生素时，抗生素提供了一有利于携带质粒的细胞群体的极有用的生长选择压。而且在运用基因工程菌进展发酵时，抗生素的参与可协助维持质粒复制与染色体复制的协调。 我们建议基因工程菌应保藏在含低浓度选择剂的培育基中。不同菌种保藏方法比较细菌的保藏.放

14、线菌菌种的保藏保藏方法主要有：沙土管法、冷冻枯燥法、液氮冷冻法 放线菌菌种的长期保藏依保藏放线菌的分生孢子为主要方式。.2.5 微生物活力和稳定性测定 一切保藏菌种的方法都必需是长期可靠地坚持菌种的优良性状不变。在保藏时定期检测菌种活力，以确定保藏培育物的保藏期限和保藏方法的可靠性，以及确定在实践保藏过程中出现的细胞死亡程度和遗传稳定性。对工业微生物消费菌种来说，建议保藏菌种的形状学和生化特征(如代谢产物的产生、酶活力、遗传特征及生化目的)应在保藏后加以检测和确定。 加速保藏实验可用于预测保藏过程中保藏培育物的稳定性。在一给定温度下经过对高温下短期活力丧失程度检测，可以用来预测嗜酸乳杆菌的稳定

15、性。 胜利的菌种长期保藏方法之有价值的目的包括在保藏6个月、1年或更长时间后存活百分率(或存活单位)。细胞群体的形状学特征或一些特别的生化特征应在菌种保藏前后坚持同一性，以及实验室中、中试车间中和消费发酵中产品滴度的稳定性，后者极为重要。第十节 菌种的衰退与复壮 在生物进化的历史长河中，遗传性的变异是绝对的，而它的稳定性反而是相对的；退化性的变异是大量的，而进化性的变异却是个别的。在自然情况下，个别的顺应性变异经过自然选择就可保管和开展，最后成为进化的方向；在人为条件下，人们也可以经过人工选择法去有认识地挑选出个别的正变体用于消费实际中。相反，如不自觉、仔细地去进展人工选择，大量的自发突变菌株

16、就会趁机泛滥，最后导致菌种的衰退degeneration。 在长期接触菌种的实践任务人员中，都有这样的领会，即假设对菌种任务长期放任自流，不搞纯化、复壮rejuve-nation和育种，那么菌种就会对他进展“惩罚，反映到消费上就会出现继续的低产、不稳产。这阐明菌种的消费性状也是不进那么退的。菌种衰退的表现对产量性状来说，菌种的负变就是衰退。其他原有的典型性状变得不典型时，也是衰退。最易觉察到的是菌落和细胞形状的改动。生长速度缓慢，产孢子越来越少。代谢产物消费才干或其对宿主寄生才干的下降。衰退还表如今抗不良环境条件抗噬菌体、抗低温等才干的减弱等。 菌种衰退的本质菌种的衰退是发生在细胞群体中的一个

17、由量变到量变的逐渐演化过程。开场时，在一个大群体中仅个别细胞发生负变，这时如不及时发现并采取有效措施，而一味移种传代，那么群体中这种负变个体的比例逐渐增大，最后让它们占了优势，从而使整个群体表现出严重的衰退。所以，在开场时所谓“纯的菌株，实践上其中已包含着一定程度的不纯要素；同样，到了后来，整个菌种虽已“衰退了，但也是不纯的，即其中还有少数尚未衰退的个体存在着。复壮的概念狭义的复壮仅是一种消极的措施，它指的是在菌种已发生衰退的情况下，经过纯种分别和测定消费性能等方法，从衰退的群体中找出少数尚未衰退的个体，以到达恢复该菌原有典型性状的一种措施；而广义的复壮那么应是一项积极的措施，即在菌种的消费性能尚未衰退前就经常有认识地进展纯种分别和消费性能的测定任务，以期菌种的消费性能逐渐有所提高。所以，这实践上是一种利用自发突变正变不断从消费中进展选种的任务。 二、菌种的衰退与复壮1从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，重新获得具有原有典型性状的菌种。2有认识地利用微生物会发生自发突变的特性，在日常的菌种 维护任务中不断挑选“正变个体。大量群体中的自发突变菌种的复壮：a纯种分别；b经过寄主体进展复壮；菌种衰退的特点：实际中关于防止菌种衰退和进展复壮的阅历 一衰退的防止 1控制传代次数 2发明良好的培育条件 在实际中，有人发现如发明一个适宜原种的