一种新型海洋来源的蒽环类化合物D19抗肿瘤活性及机制研究

1、一种新型海洋泉源的蒽环类化合物D19抗肿瘤活性及机制研究袁洁,何振健,吴珏珩,朱勋【摘要】目的探究新型海洋源性蒽环类化合物d19的抗肿瘤作用及分子机制。要领接纳四甲基二氮唑蓝(tt)比色法、脱氧核糖核酸末了转移酶介导的缺口末了标识表记标帜法(tunel)、免疫印迹法(esternbltting)检测d19对人乳腺癌细胞系f-7和da-b-435生长的影响及相干信号通路卵白的变革。结果d19对f-7、da-b-435的半数按捺浓度(i50)别离为4.01l/l和7.32l/l;d19具有有用诱导人乳腺癌细胞凋亡的作用;esternbltting结果表现d19作用后细胞中的凋亡卵白如aspase9

2、以及卑劣的效应卵白parp都产生裂解。结论从细胞水安然平静分子程度证实新型海洋源性蒽环类化合物d19具有很强的抗乳腺癌活性，有大概生长成为治疗乳腺癌等其他实体肿瘤的先导化合物。【关键词】海洋共生微生物;抗肿瘤;蒽环类化合物;人乳腺癌细胞;凋亡keyrds:arineensalirrganis;antineplasti;anthrayline;huanbreastanerells;apptsis恒久以来，恶性肿瘤不停严峻威胁着人类康健与生命。据天下卫生构造统计，全天下每年约有600万人被癌症夺去生命，预计到2022年将升至1000万人1。此中乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，并且是实体瘤中应用化

3、疗最有用的肿瘤之一。因此探求有用的抗肿瘤化合物对付乳腺癌的治疗具有紧张的意义。蒽环类化疗药物是如今临床应用普及的抗肿瘤一线化疗药物，尤其是乳腺癌化疗中最常用的药物，但是此类药物仍存在骨髓按捺性、心脏毒性题目，以及肿瘤患者恒久利用出现的多耐药征象，大大限定了其剂量进步和临床治疗结果2-4。因此，有需要探求更好的同类化疗交换药物5。本文从分子水安然平静细胞程度对海洋微生物泉源的蒽环类化合物d19抗人乳腺癌作用举行了研究，为该化合物终极成为抗肿瘤药物提供理论根据，并为进一步开拓高效低毒的抗肿瘤新型候选药物奠基基矗1质料与药物人乳腺癌细胞系da-b-435、f-7为本实行室保存，并已在本实行室已颁发的

4、其他研究工程中利用6。d19由中山大学化学与化学工程学院林永成传授提供7。种种化合物由二甲基亚砜(ds)(siga公司)制备保存母液。2要领2.1细胞造就人乳腺癌细胞系f-7、da-b-435造就于含5%()胎牛血清(hylne公司)、2l/ll-谷氨酰胺、0.1l/l非必须氨基酸、10l/lhepes(缓冲液)、100iu/l青霉素和100g/l链霉素的de完全造就基中(以上细胞造就相干试剂均为invitrgen/gib公司产物，购自invitrgen公司)，置于375%()2孵箱中孵育造就。传代时用含0.02%edta的0.05%()胰酶消化，以de完全造就基停顿消化。2.2四甲基偶氮唑蓝

5、(tt)比色实行将f-7和da-b-435细胞消化后计数，按每孔1.0104个细胞别离接种至96孔细胞造就板中，置于375%2孵箱中孵育造就。24h后调换为含浓度依次为0、0.001、0.05、0.1、0.5、1、2、3、4l/ld19的造就基，每个浓度均设3个平行复孔，继承造就48h后，显微镜下不雅察细胞形态及生长的变革。随后每孔参加质量浓度为5g/ltt(genvie公司，用1磷酸盐缓冲液溶解，终质量浓度5g/l，过滤除菌，分装后-20避光保存)溶液20l，37作用4h，离心后弃上清液，参加ds150l，振荡器振荡10in充实溶解结晶，置酶标仪上测定波长为490n下的吸光度a值，按以下公式

6、盘算按捺率。细胞生长按捺率(%)=(比较组均匀a值-实行组均匀a值)/比较组均匀a值100%。比较组即d19浓度为0的造就孔。利用半数按捺浓度(i50)盘算软件blissssftare盘算i50，应用spss软件行数据统计阐发。2.3脱氧核糖核酸末了转移酶介导的缺口末了标识表记标帜法(tunel)染色将f-7细胞消化后计数，按每孔1.0105个细胞别离接种至已铺有盖玻片的24孔细胞造就板中，24h后用0.1l/ld19处置惩罚细胞。将50lterinaldexynuletidyltransferase(tdt)反响缓冲液加至细胞上，将造就板置于湿盒中于37避光反响60in。吸弃反响液，参加2s

7、s室温作用15in，用pbs洗涤3次，每次5in。参加1g/lpi避光作用15in，再用pbs洗涤3次，每次5in。末了将盖玻片上的细胞避光枯燥留宿，越日加anti-fade封片。在荧光显微镜下举行不雅察并照相保存图片，tunel染色阳性荧光信号呈绿色，pi荧光信号呈赤色。tunel细胞凋亡检测试剂盒为prega公司产物。2.4esternbltting检测相干卵白网络得到差异浓度梯度处置惩罚的细胞裂解液，按ba法举行卵白定量(美国piere公司)。电泳后，转膜到pvdf膜上，结实后常温孵育3h或4留宿，鼠抗人aspase-9(美国bdbisienes公司);兔抗人parp(美国ellsign

8、alingtehnlgy公司);-tubulin(美国siga公司)，再孵育相应二抗(美国piere公司)，末了在暗房用el显色液(美国piere公司)显色发光。3结果3.1d19对乳腺癌细胞的按捺作用d19对人乳腺癌细胞f-7和da-b-435的生长按捺作用出现显着的剂量依靠性，对低分化、高侵袭性的乳腺癌细胞da-b-435按捺率最高，对低致瘤性、对低转移的人乳腺癌f-7按捺率其次(见图1)。其作用48h的半数生长按捺浓度(i50)别离为4.01l/l和7.32l/l。psa6691;s*2图1d19对人乳腺癌细f-7和da-b-435作用48h的剂量-按捺结果figure1thedse-d

9、ependantprliferatininhibitineffetfd19inhuanbreastanerelllines,f-7andda-b-435eretreatediththeindiatednentratinsfr48hd19处置惩罚48h后，f-7、da-b-435细胞密度较比较组显着低落，随着药物浓度的增长，细胞密度进一步明显低落。在光学显微镜下放大200倍可不雅察细胞出现典范的细胞凋亡形态学变革，贴壁细胞开始出现体积变孝变形、皱缩、变圆、脱落(见图2、3)。psa6692;s*2图2人乳腺癌f-7细胞经差异浓度的d19作用48h后的形态学变革(200)figure2rphlgi

10、alhangesff-7huanbreastanerellstreatedithindiatednentratinsfd19after48h(200)3.2d19抗肿瘤活性的机制为进一步明白d19导致人乳腺癌细胞f-7凋亡的分子机制，本文以时间梯度收f-7的总卵白做esternbltting。随着处置惩罚时间渐渐增长，aspase-9和parp的前体渐渐淘汰，切割体渐渐增长(见图6)。-tubulin作为内参。结果表现，d19作用后的f-7细胞通过激活aspase诱导细胞凋亡。psa6696;s*2图6d19作用后人乳腺癌细胞f-7中aspase9和parp的表达程度变革figure6tie-

11、dependenteffetfd19naspase9andparpinf-74讨论肿瘤的化疗、放疗及生物学疗法是治疗肿瘤的紧张本领，这些本领的重要机制在于利用化学药物、放射线或免疫制剂诱导肿瘤细胞产生凋亡。比年来研究一些抗肿瘤药物的作用机制时，除了研究其对dna等大分子化合物合成及其布局的影响外8，还研究其对细胞凋亡的影响，创造抗代谢药物中的甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、tp-i酶按捺剂喜树碱、tp-ii酶按捺剂鬼臼乙叉甙、阿霉素，以及顺铂、三尖杉酯碱、紫外线及-射线等，均可诱导细胞凋亡。因此以为细胞凋亡对肿瘤产生生长起着紧张作用。假设对凋亡与抗肿瘤药物之间的干系举行深化研究，有大概改进如

12、今肿瘤临床药物治疗的结果。海洋作为一种特别的生长情况(高盐、高压、缺氧、缺少阳光等)，使海洋生物可以或许产生并积聚大量化学布局、生理活性与成效均非常特别的物质，为此提供了一个富厚的新奇布局的化合物库9-12。蒽环类化合物以阿霉素、表阿霉素为代表，具有抗肿瘤的生物活性13-14。本研究结果表白，从南海海洋共生微生物的次生代谢产物中挑选到的d19，具有蒽环类化合物的根本骨架。在体外实行中对人乳腺癌细胞表示出显着的抗肿瘤活性。值得留意的是，其对低分化、高侵袭性的乳腺癌细胞da-b-435按捺率最高(i50=4.01l/l)，对低致瘤率、低转移的人乳腺癌f-7按捺率稍低(i50=7.32l/l)。提示

13、d19按捺肿瘤细胞生长的分子机制中大概存在对恶性肿瘤特异性的靶点。如今以为，诱导细胞凋亡重要有aspase依靠途径和非aspase依靠途径，而以aspase依靠途径为主，aspase激活有外源性和内源性两条途径15-18。为了探究d19的抗肿瘤作用分子机制，用tunel染色法阐发了d19引起的细胞变革，创造该化合物能有用诱导人乳腺癌f-7细胞凋亡。同时esternbltting结果表现d19作用后，乳腺癌细胞中的凋亡卵白如aspase9及卑劣的效应卵白parp都产生裂解，说明d19可以或许诱导细胞通过aspase依靠的细胞凋亡而发挥抗肿瘤的活性。这一结果为深化研究d19抗肿瘤活性的分子机制提供

14、了线索。【参考文献】1天下卫生构造秘书处陈诉.防范和操纵癌症r.第五十八届天下卫生大会，2022.2aadrl,jienj,paz-aresl,etal.prgressinthedevelpentandaquisitinfantianeragentsfrarinesuresj.annnl,2022,14(11):1607-1615.5孙燕,谷铣之.肿瘤综合治疗的原那么和理论j,中国肿瘤,1999,8:21-23.6lijun,zhangnu,sngli-bing,etal.astryteelevatedgene-1isanvelprgnstiarkerfrbreastanerprgressin

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