2013区基金中期评估-41实施方案

1、组织因子激活 ERK 通路在肝癌脉癌栓形成中的作用项目实施方案(一)内容本项目拟期实验的基础上TF 介导 ERK 信号调控肝癌脉癌栓形成的分子机制,针对 TF 或 ERK 进行靶向实验治疗干预肝癌下 3 点：脉癌栓的形成，其主要内容包括以（1）TF 介导 ERK 信号调控肝癌脉癌栓形成的分子机制。对前述分离出来的肝癌门静脉癌栓细胞，在用 RNAi 技术沉默 TF 的表达及抑制剂阻断 ERK 激活后，用商业化的芯片、蛋白等方法检测处理前后相应的、蛋白的变化，重点关注金属基质蛋白酶类、促生成因子类、类、粘附分子类等，用 Western blot、定量 PCR 法进行验证。并且比较用 RNAi 技术

2、沉默 TF 的表达与抑制剂阻断 ERK 激活后引起情况，分析是否有除 ERK 外其他的信号通路也参与了 TF 介导的肝癌、蛋白改变的脉癌栓细胞的生长增殖和迁移侵袭。对确认有改变的、蛋白，通过 RNAi 沉默表达及载体过表达、小分子抑制剂或激活剂等方法，它们在细胞生长增殖、侵袭转移等过程中的作用，探讨它们与肝癌（2）脉癌栓形成的相关性。TF 在肝癌、脉癌栓等组织、细胞株中的表达情况和临床、病理等指标的相关性。本课题首先利用依托于中山大学附属第一医院，进一步收集临肝癌合并脉癌栓患者的血清（包含术前、术后血清）、手术切除组织（包括正常肝组织、癌旁组织、癌组织、癌栓组织）和肝癌不合并脉癌栓患者血清（包

3、含术前、术后血清）、手术切除组织（包括正常肝组织、癌旁组织、癌组织）至少各 100 例，用 ELISA、Western blot、定量PCR 法等检测血清、组织中 TF、pERK 及下游相关的表达与临床、病理等指标的相关性。分离培养、蛋白的表达情况，分析 TF、pERK 等的脉癌栓组织及相应的肝癌组织的原代细胞至少各 3 对，同时收集常规肝癌细胞株包括 Bel-7402、HepG2、SK-Hep-1、SMMC-7721、Hep3B、HCC-9204、MHCC97-L(低转移)、MHCC97-H（高转移）等，综合检测这些细胞株 TF、pERK 及下游相关、蛋白的表达情况和生长增殖、侵袭转移等情况

4、。对于 TF 高表达的细胞，采用 RNAi 技术沉默 TF 的表达，然后检测 pERK 及下游相关分子表达情况和生长增殖、侵袭转移等情况。对于 TF 低表达的细胞，采用载体介导的过表达 TF 方法，然后检测pERK 及下游相关、蛋白的表达情况和生长增殖、侵袭转移等情况，系统分析 TF 的表达与这些指标的相关性。（3）的肝癌体内靶向 TF 或 ERK 进行实验治疗干预肝癌脉癌栓的形成。选取前述分离出来脉癌栓细胞 2-3 株，建外稳定沉默 TF 表达的细胞株，然后在 鼠肝内形成原位瘤，对比有无沉默 TF 时肝内原位瘤大小数量脉癌栓形成等情况（ex vivo 实验）。对成功建立的 鼠肝内原位瘤模型，

5、采用尾静脉注射针对 TF 的 siRNA 或者腹腔注射阻断 ERK的抑制剂，对比有无沉默 TF 或阻断 ERK 时肝内原位瘤大小数量vivo 实验）。脉癌栓形成等情况（in2.拟解决的关键问题（1）阐明 TF 介导 ERK 信号调控肝癌脉癌栓形成的分子机制。（2）分析 TF 在肝癌、关性。脉癌栓等组织、细胞株中的表达情况和临床、病理等指标的相（3）探讨体内靶向 TF 或 ERK 进行实验治疗干预肝癌脉癌栓的形成的可能性。(二)11.1（1）方法、技术路线方法实时定量 PCR（Real timeive PCR）：Trizol 裂解细胞或液氮研磨组织粉末，氯丙醇和三氯甲烷法提取总 mRNA，琼脂糖

6、凝胶电泳检测 mRNA 纯度和有无降解。（2）（3）按照 TAKARA 逆转录试剂盒操作行逆转录，得到总 cDNA;以 cDNA 为模板，按比例加入引物、Paster MIX， SYBR Green（每个样本每个指标做三个重复），按照 Arism7000 实时定量 PCR 仪操作规程检测；（4）检测指标 mRNA 的表达水平用仪器配套的 SDS1.1 软件分析，内参选择 GAPDH。1.2 Western blot（1）（2）（3）（4）（5）（6）1.3（1）以含蛋白酶抑制剂的裂解液提取细胞或组织总蛋白，Bradford 法蛋白定量；90mA 恒流 SDS 电泳；90V 恒压转膜 120 分

7、钟，将蛋白转至硝酸染色，根据 Marker 条带位置和目的蛋白大小剪膜；含 5%脱脂奶粉和 TBST 封闭液常温封闭膜 1h；4孵育 1 抗过夜；TBST 洗膜 10min3 次，常温孵育 2 抗 1h； TBST 洗膜 10min3 次，ECL 法发光；图像扫描、分析。细胞培养素膜；组织块在培养皿中，剔除血污和坏死组织；剪碎加入胶原酶置于 37孵箱消化20min；（2）（3）（4）培养。 1.4（1）度；（2）镜下观察消化恰当，200 目细胞筛网过滤至含胎牛血清的 DMEM 培养液中；滤液离心，弃上清，加入 D-Hands 液混匀，再次离心；去除上清，沉淀中加入 10%FBS DMEM 培养

8、液 2-3ml 悬浮细胞；移入细胞培养箱中转染六接种对数期生长的细胞，37，5%CO2 培养箱中培养过夜，至细胞 80%汇合DNA/脂复合物配制：分别将 2g DNA 和 5l Lipofectamine 2000 稀释于200lDMEM 无血清培养基中，室温孵育 5min 后将两者混合，使 DNA 与阳离子脂结合并室温孵育 20min；（3）吸去细胞培养液，PBS 洗 2 遍，将上述 400l DNA/脂复合物和 400l 无血清 DMEM 培养基轻混合后加入六。在 37，5%CO2 培养箱温育 4-6h；（4）（5）1.5吸去培养液，加入含 10%FBS 的 DMEM，37，5%CO2 培

9、养箱中培养 24-48h；根据实验目的提取 mRNA，或提取总蛋白或将细胞直接用于后续操作。稳定细胞株筛选：（1）（2）（3）（4）（5）按照上述方法将目的质粒转染至细胞（24），培养 24h；用含有 G418（500g/ml）的完全培养基培养细胞；更换培养（含 G418），如此培养 10-14 天；多数细胞于 10 天后，挑去部分呈岛装生长的细胞团于 96培养，扩增；提取总蛋白，行免疫印迹检测目的蛋白的表达变化；符合预期标准的细胞株为稳定转染细胞株，用于下一步实验。1.6免疫组化和微密度（MVD）检测（1）免疫组化：石蜡切片水化抗原修复5%BSA 封闭抗 4孵育过夜抗常温孵育 1hEnvi析

10、。两步法 DAB 显色苏木精复染脱水封片镜下图像，数据分（2）微密度判断：凡染成棕黄色、数个内皮细胞或内皮细胞作为一个计数。先用低倍镜选取（40）3 个高密度区域，再转到镜（200）下计数每个区域微1.7（1）数量，以其平均值作为每例的 MVD。细胞侵袭实验Transwell 小室的底部加入含 10%胎牛血清的培养基作为趋化因子，在 Transwell上室的膜上铺以 50l 的 Matrigel 溶液，37放置过夜。（2）（3）20min；（4）1.8（1）弃除剩余液体后于膜上铺 400l 的细胞悬液（含 1105 个细胞），继续培养 6h；取出小室，棉签擦除上室内定的细胞，甲醇常温固定 15

11、min，0.1%结晶紫染色显微镜下随机挑取 10 个鼠体内成瘤、转移实验镜视野计数穿膜的细胞。胰酶消化收集处于对数生长期的细胞，PBS 洗 3 次，离心沉淀，充分吹打悬浮于无血清 DMEM 培养液中；（2）根据实验目的肝脏原位给每只 鼠注射 106 个细胞（0.1ml 悬液）：SPF 饲养小鼠，观察小鼠生存期，小鼠取瘤计算大小（以游标卡尺测量肿瘤的长（a）短（b）径，计算肿瘤的大小：1/2 *ab2）；计数肝内外转移瘤数目，组织切片镜下观察门脉癌栓的情况和密度。2技术路线本项目的技术路线如下图 2：图 2 本项目的技术路线图(三)项目进度及阶段目标in vivoex vivoTFpERKTFpERK2014 年 1 月 - 2014 年 4 月TF 激活 ERK 信号调控肝癌 脉癌栓形成的分子机制； 相关前期实验试剂盒耗材；为项目开展做好前期准备。2014 年 5 月 - 2014 年 12 月收集性肝癌伴脉癌栓患者标本和临床资料。TF 在肝癌、脉癌栓等组织、细胞株中的表达情况和临床、病理等指标的相关性。2015 年 1 月 - 2015 年 9 月体内靶向 TF 或 ERK 进行实验治疗干预肝