《法医物证鉴定动物DNA种属鉴定技术规范》

1、ICS点击此处添加ICS号点击此处添加中国标准文献分类号DB34安徽省地方标准DB 34/ XXXXXXXXX法医物证鉴定动物DNA种属鉴定技术规范点击此处添加标准英文译名点击此处添加与国际标准一致性程度的标识XXXX - XX - XX发布XXXX - XX - XX实施安徽省市场监督管理局发布DB/ XXXXXXXXX前 言本技术规范按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本技术规范由安徽省司法厅提出。 本技术规范由安徽省市场监督管理局归口。 本技术规范起草单位：安徽新莱蒂克司法鉴定中心、安徽仁吉康生物

2、技术有限责任公司、安徽省司法鉴定协会。 本技术规范主要起草人：张黎黎、鲍加琪、赵莎莎、王陈成、余春晓、王彪、许云斐、刘慧。法医物证鉴定动物DNA种属鉴定技术规范1 范围本技术规范规定了安徽省司法鉴定机构法医DNA实验室进行DNA种属鉴定的基本要求、检验程序、质量控制、鉴定意见和鉴定文书。本技术规范适用于安徽省法医DNA实验室对含有DNA的生物检材（包括但不限于血液、毛发、羽毛、组织、骨骼、牙齿等）的物种来源进行确认，确认范围为兽类（包括人）、鸟类、爬行类、两栖类。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，

3、其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GA/T 382-2014 法庭科学DNA实验室建设规范GA/T 383-2014 法庭科学DNA实验室检验规范SF/Z JD0105008-2018 法医物证鉴定线粒体DNA检验规范SF/T 0069-2020 法医物证鉴定实验室管理规范SN/T 4626-2016 DNA条形码物种鉴定操作规程CNAS-CL08:2018 司法鉴定/法庭科学机构能力认可准则CNAS-CL08-A002:2018 司法鉴定/法庭科学机构能力认可准则在法医物证 DNA 鉴定领域的应用说明3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 法医物证鉴定鉴定人运用法医物证学

4、的科学技术或者专门知识，对各类生物检材进行鉴别和判断并提供鉴定意见的活动。3.2 DNA种属鉴定DNA种属鉴定指的是通过DNA序列分析对生物检材的种属来源进行鉴定。广义上的种属鉴定包括动植物的类属确定，狭义的种属鉴定指的是动物的生物检材的种属来源鉴定，即确定检材是否属于人体所有，有时还要确定检材属于何种动物。3.3 遗传标记遗传标记是指在DNA序列分析中用作标记的基因，也称为标记基因。3.4 线粒体 DNA 线粒体DNA（Mitochondrial DNA, mtDNA）是指位于线粒体中的DNA，呈双链环状结构，有编码区和非编码区。常用的遗传标记有控制区、12SrRNA、16SrRNA、细胞色

5、素c氧化酶亚基（Cytochrome c oxidase subunit I gene, CO I）以及细胞色素b（Cytochrome b, Cyt b）等。3.5 BLAST比对BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）是基于局部序列比对，对数据库进行快速搜索，其特点是仅搜索序列之间高度相似的区域，可以兼顾到搜索的精确性和搜索速度，是目前应用最广泛的序列相似性搜索工具之一。 BLAST 的运行方式是先用目标序列建立数据库，数据库里面的每一条序列为目标序列，然后用查询序列与数据库中的目标序列做两两序列局部比对，从而得到全部比对结果。包括BLASTN和BL

6、ASTP，BLASTN是将给定的核酸序列与核酸数据库中的序列进行比较；BLASTP是使用蛋白质序列与蛋白质数据库中的序列进行比较。本规范应用的是BLASTN。3.6 基因序列相似度基因序列相似度（Sequence similarity）是指进行序列比对时，检测序列与目标序列之间相同DNA碱基数与检测序列全部碱基数的比值。3.7 MSPMSP（Maximum-scoring segment pair）代表在数据库中进行Blast检索时，与被检测序列相似度最高的序列。3.8 系统发育树系统发育树（Phylogenetic trees）是表明被认为具有共同祖先的各物种间演化关系的树。4 基本要求4.

7、1 鉴定机构应具有从事法医物证的执业范围，且应满足如下要求： a) 对所有影响鉴定结果的人员岗位规定相应的能力要求，包括教育、资质、培训、专业知识、技能等，并保留相关记录；制定适宜的培训计划并组织实施； b) 依据鉴定方法和要求对鉴定人以及参与鉴定工作的人员进行监督，以评价其鉴定工作的符合性和满意程度；监督的结果应作为培训需求评价的依据之一； c) 具有能识别样本的标识系统，并确保样本在鉴定过程期间能得到持续的识别； d) 建立样本的运输、接收、处置、保护、存储、保留和/或清理的规定，应对接收、内部传递、处置、保留、返还和清理等过程进行记录，确保记录的完整性和可追溯性。 4.2 鉴定人应具有法

8、医物证鉴定执业资格，熟悉并掌握线粒体DNA检验的方法和原理，并能正确评价结果。 4.3 鉴定活动应包括检验（采样、DNA提取和纯化、DNA定量分析、DNA测序、遗传信息分析）、鉴定意见判断、鉴定文书撰写等环节。鉴定活动完毕后，应将各个环节的记录进行归档。5 检验程序5.1 采样要求5.1.1 含有DNA的生物检材（包括但不限于血液、毛发、羽毛、组织、骨骼、牙齿等）均可采集。5.1.2 样本应分别包装，注明编号、采样日期等。5.1.3 样本采集后应及时进行实验或冷冻保存（注：冷冻保存温度为-20，时间不超过3个月）。5.2 DNA 提取和纯化按照GA/T 383-2014中附录A的方法执行。5.

9、3 DNA 定量分析按照GA/T 383-2014中6.16.3的方法执行。5.4 MtDNA测序根据需要，可选择单个或多个遗传标记，通过Primer数据库获取通用引物，或自行设计引物进行PCR扩增和测序。本技术规范提供了两个通用引物的体系示例供参考，操作如下：a) PCR 扩增PCR 扩增体系：反应组分原浓度终浓度10× PCR Buffer10×1×MgCl2（mmol/L）251.25dNTPs（mmol/L）100.2Taq 酶（U/L）20.05引物（mol/L）1.250.25模板DNA（ng/L）5-251-5ddH2O12SrRNA引物对：F：5&

10、#39;-AAACTGGGATTAGATACCCCACTAT-3'R：5'-GAGGGTGACGGGCGGTGTGT-3'CO I引物对：F：5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'R：5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'PCR 扩增条件：95，5 min；95 30 s，55 40 s，72 30 s，35 个循环；72，7 min。b) 测序利用遗传分析仪对PCR产物进行双向测序，得到DNA序列信息。5.5 遗传信息分析5.6.1 BLAST比对获得的DNA序列通过NCBI数据库中的在

11、线序列Blast工具()，在数据库进行搜索。5.6.2 系统发育树的构建 根据Blast搜索结果，当MSP有多个物种序列时，下载这些物种的基因序列，同时下载远源物种的基因序列作为外群序列。利用专业分析软件构建系统发育树。6 质量控制从事DNA种属鉴定的实验室至少应该包括以下质量控制措施： 6.1 对照设置 为保证DNA测序结果的准确性，要求每次实验过程中均设置阳性对照和阴性对照。阳性对照：PCR扩增添加Control DNA作为阳性对照。阴性对照包括：（1）提取试剂的空白对照，用于监控从提取到分析环节是否存在污染；（2）PCR试剂的空白

12、对照，用于监控从扩增到分析环节是否存在外源DNA污染。6.2 双向测序 为避免潜在的异质性影响和保证结果的可靠性，宜进行正、反链双向测序。 6.3 污染防控 根据CNAS-CL08-A002:2018法医物证DNA实验室的相关要求，从事DNA种属鉴定实验室应采取（但不限于）以下措施以防止污染：a)检材在实验室工作区间的单向流动；b)做好实验人员的自身防护，如使用个人防护装备，包括作业服、一次性使用手套、一次性使用口罩和一次性使用发罩，并根据具体情况及时更换；c)做好设备、设施的定期清理和消毒；d)具备实验区的外部屏障，能有效阻止无关人员未经许可进入实验区。 7 鉴定意见7.1 根据 DNA 检验结果的遗传信息分析进行鉴定意见判断。 7.2 鉴定意见判断可参考以下原则： a） 当检测序列与MSP的基因序列相似度为99-100%，且MSP所代表动物为单个物种时，可认为MSP所代表动物与检材所属动物为同一种； b） 当检测序列与MSP的基因序列相似度为99-100%，且MSP所代表动物为多个物种时，