基因工程复习内容整理

1、第二章 基因操作的主要原理1、核酸凝胶电泳的原理及分类？在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态。将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移率取决于核酸分子本身的大小和构型。分子量较小的DNA分子，比分子量较大的分子具有更紧密的构型，所以其电泳迁移率也就比同等分子量的松散型的开环DNA分子或线性DNA分子要快些。分类：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、脉冲电场凝胶电泳。2、影响DNA迁移率的因素有那些？DNA分子量大小；DNA的构象；凝胶的浓度。3、EB的作用原理。一种具扁平分子的核酸染料，可插入到DN

2、A或RNA分子的碱基之间。在300nm紫外灯照射下发射出荧光。4、核酸分子杂交所依据的原理是什么？有那几种杂交方式？带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。杂交方式有:DNA/DNA印迹杂交Southern Blotting；RNA/RNA印迹杂交Northern blotting；斑点印迹杂交和狭线印迹杂交；菌落或噬菌斑杂交。5、细菌转化的技术方法。原生质体转化法、化学转化法、电穿孔法。6、Sanger的双脱氧链终止法的技术路线？利用了DNA聚合酶的两种特性：第一，它能够利用单链的DNA做模板，合成出准确的DNA互补链；第二，

3、DNA聚合酶能够利用2,3-双脱氧核苷酸做底物，使之参入到寡核苷酸连的3末端，从而终止链的生长。技术路线：见书7.化学修饰法的技术路线：见P71，参考技术图8.PCR的原理：双链DNA分子在高温下解链成两条单链DNA，然后DNA聚合酶在有一对寡核苷酸引物的存在的情况下，以单链DNA为模板利用反应混合物中的dNTPs合成新生的DNA互补链。并且，每一条新生链上都具有了新的引物结合位点。然后反应混合物再经过上述过程，即可有合成新链。如此反复循环，即可实现特定区段DNA的迅速大量扩增。9.简并引物：一类由多种寡核苷酸组成的混合物，彼此之间仅有一个或数个核苷酸的差异。Taq聚合酶：有5®3D

4、NA聚合酶活性；无3®5外切酶活性；最适聚合酶温度72，连续保温30min具有相当活力，选择72延伸；变性温度：95使其在整个扩增循环中保持足够活性。Pfu聚合酶：耐热；有5®3DNA聚合酶活性和35外切酶活性；精确度：pfu >Taq，但pfu扩增效率通常比Taq酶略差反向PCR：是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段，对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。10.盒式取代诱变的原理：利用一段人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段，即寡核苷酸盒取代野生型基因中的相应序列。这种寡核苷酸盒是由两条合成的寡核苷酸组成的，当它们退火时，会按设计要求产生出需要的粘性

5、末端。Kunkel定点诱变： 将待突变的基因克隆入RF-M13 DNA载体上，导入具有dUTP酶（dut-）和N-尿嘧啶脱糖苷酶（ung-）双缺陷的大肠杆菌（dut-，ung-）菌株中。 dUTP酶缺陷导致细胞内dUTP水平上升，并在DNA复制时，部分取代dTTP进入DNA新生链中。又由于ung缺陷使掺入DNA的dUTP残基不能除去。由这种大肠杆菌菌株产生的M13单链DNA大约有1%的T被U所取代，然后进行DNA定点诱变。 双链DNA导入正常的大肠杆菌中，其尿嘧啶N-糖基化酶除去DNA链上的尿嘧啶碱基。结果原来的M13模板链被降解，只有突变链因不含U，被保留下来。这种方法产生的M13噬菌体中含

6、有突变DNA的比例大大增加。重组PCR定点诱变：详见P9811.凝胶阻滞实验原理：DNA与蛋白质结合后分子量变大，改变了迁移率，由此判断DNA是否与蛋白质发生结合。竞争DNA的作用：反应体系中加入超量的非标记竞争DNA，用于研究DNA与蛋白质作用的专一性。12.DNaseI印迹试验原理：详见P115，参考技术图13.甲基化干扰试验原理：根据DMS（硫酸二甲酯）能够使G残基甲基化，而六氢吡啶又能够特异切割甲基化的G残基这一原理。第三章1、限制性内切酶识别DNA的特点？什么是同裂酶，什么是同尾酶？型酶：分子量较大，反应需Mg2+、S-腺苷酰-L-甲硫氨酸（SAM）、ATP等。 这类酶有特异的识别位

7、点但没有特异的切割位点，而且切割是随机的，所以在基因工程中应用不大；型酶（狭义的限制性内切酶）：分子量较小（105 Da），只有一种多肽，通常以同源二聚体的形式存在。反应只需Mg2+的存在，并且具有以下两个特点，识别位点是一个回文对称结构，并且切割位点也在这一回文对称结构上。 许多型酶切割DNA后，可在DNA上形成粘性末端，有利于DNA片段的重组。（1）基本特点在DNA双链的特异性识别序列部位，切割DNA分子，产生链的断裂。两个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的因此，断裂的结果形成的DNA片断，也往往具有互补的单链延伸末端。（2）识别顺序和酶切位点 识别-8个相连的核苷酸

8、 对称性 限制酶切后产生两个末端，末端结构是5-P和3-OH （3）末端种类 3-端突起，个数为2或4个核苷酸 5-端突起，个数为2或4个核苷酸 平齐末端 非互补的粘性末端，切点在识别顺序之外的型酶：这类酶可识别特定碱基顺序，并在这一顺序的3端2426bp处切开DNA，所以它的切割位点也是没有特异性的。同裂酶：定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制酶特点： 识别相同顺序，切割形成相同的末端 同尾酶：来源各异，识别的靶序列不同，但产生相同的粘性末端2、说明有哪些因素会影响内切酶活力的？什么是星号活力？1）DNA的纯度:污染的蛋白质、酚、氯仿、酒精、EDTA、SDS以及高浓度的盐

9、离子等都有可能抑制核酸内切酶活力。（2）DNA的甲基化程：基因克隆中采用失去甲基化酶的大肠杆菌菌株制备质粒DNA。（3）酶切消化的反应温度大多数核酸内切酶的反应温度在37，有些酶例外。（4）DNA的分子结构：DNA分子的不同结构对核酸内切酶的活性有很大影响（5）核酸内切酶的缓冲液（-20保存）主要成分： 氯化镁、氯化钠、氯化钾，Tris-HCl，-巯基乙醇，二硫苏糖醇（DTT）Mg2：酶发挥活性必需，不正确的Mg2和NaCl会影响对特异序列的识别。Tris-HCl：保证酶反应的pH，一般在pH 7.4条件下功能最佳巯基乙醇：保持某些酶的稳定性；甘油的影响（星号活性）例：EcoR在正常情况下识别

10、GAATTC，但是如果甘油浓度超过5（V/V），识别序列发生变化，可在AATT或PuPuATPyPy序列处发生切割。3、试举例说明什么是同聚物加尾法、衔接物法和接头连接法？见书上图。4、什么是Klenow片段，如何进行DNA末端标记？Klenow片段:由大肠杆菌DNA聚合酶经枯草杆菌蛋白酶的处理之后，产生出来的分子量为76×103dal的大片段分子。仍具有53的聚合酶活性和35 的外切酶活性，失去了全酶的53外切酶活性。 具有 3隐蔽末端的带标记得的DNA片断 5GATCT3 3 A5 在反应物中加入Klenow聚合酶-32p-dGTP，一道温育后生成： 5GATCT3 3 *GA5

11、 或是同时加入-32p-dATP dGTP 5GATCT3 3 *AGA55、T4 DNA取代合成法标记DNA的方法n 在反应过程中，通过T4 DNA聚合作用，反应物中的-32p-dNTP逐渐地取代了被外切活性删除掉的DNA片段上原有的核苷酸，因此叫做取代合成。n 3外切酶活力可以切割ds DNA和ss DNA，ds DNA>ss DNA，要控制降解时间。（图见书上）6、反转录酶的作用方式n 链具有聚合酶活性和RNase H活性n 链具有以RNA-DNA杂交分子为底物的53脱氧核酸外切酶活性7、T7 DNA聚合酶的特点n 1978年，S. Tabor从感染了T7噬菌体的大肠杆菌寄主细胞中

12、纯化出来的一种核酸酶。n 加工形式的T7 DNA聚合酶系：T7噬菌体编码的基因5蛋白质，另一种是大肠杆菌编码的硫氧还蛋白。n 基因5蛋白质：具有聚合酶活性和35外切酶活性；硫氧还蛋白：增强基因5蛋白质与模板引物的结合力n 具有53的聚合酶活性和很高的单链及双链的3 5核酸外切酶活性。8、DNA末端转移酶的特点n 末端脱氧核苷酸转移酶，从小牛胸腺中纯化出来的一种小分子量的碱性蛋白质，在二甲胂酸缓冲液中，能催化脱氧核苷三磷酸进行53方向的聚合作用，逐个地将脱氧核苷酸分子加到线性DNA分子的3-OH末端。n 不需要模板，可以用含有的3-OH DNA片段为引物，在3-OH端加入核苷酸达几百个。 n 它

13、作用的底物可以是具有3-OH末端的单链DNA，也可以是具有3-OH突出末端的双链DNA，平末端不是有效底物，如果用Co代替Mg做为辅助因子，可以成为有效底物。 9、碱性磷酸酶的作用n 来自于大肠杆菌或小牛肠，该酶用于脱去DNA（RNA）5末端的磷酸基团，使5-P成为5-OH，该过程称核酸分子的脱磷酸作用。当需要5端同位素标记或为了避免DNA片段自身连接（或环化）时可进行脱磷酸反应。 10、T4多核苷酸激酶特点T4多核苷酸激酶：由T4噬菌体的pseT基因编码的一种蛋白质，最初从T4噬菌体感染的E. coli中分离出来。n 作用：催化-磷酸从ATP分子转移给DNA或者RNA的末端，不受底物分子链的

14、长短限制。n 正向反应（forward reaction）碱性磷酸酶处理DNA的5端使其脱磷酸暴露出5-OH，多核苷酸激酶将-32P-ATP的-32P转移到5-OH，实现末端标记。11、简述一种核酸内切酶和一种核酸外切酶的作用特点外切酶III（Exo III）ds DNA1、一般特点： 来自于E.coli，分子量28,000 kD 2、催化反应类型 （1）外切酶活性：35，产生5-单磷酸核苷酸和具各种结构的 ds-DNA，pH 7.6-8.5 , 外切酶活性特点 反应底物：互补ds-DNA 碱基释放速度：C>>AT>>G 反应产物：5-单磷酸核苷和具缺口或5-端突起的d

15、s-DNA，过渡反应将导致DNA降解（2）核酸酶H活性：除去DNA-RNA杂交分子中的RNA分子，pH 7.6-8.5（3）3-磷酸酶活性：除去3-磷酸基后形成3-OH端，有利于DNA聚合酶反应，pH 6.8-7.4 （4）内切酶活性：在无嘌呤或无嘧啶处将DNA键切开，pH 7.6-8.5 内切酶见第一题。第4章 基因克隆的质粒载体1. 什么是载体（vector）？答：载体（vector）是由在细胞中能够自主复制的DNA分子构成的一种遗传成分，通过实验手段可使其它的DNA片段连接在它的上面，进行复制。2、 作为基因工程的载体，必须具备哪些性能？质粒载体必须具备的基本条件是什么？答：作为基因工程

16、的载体，必须具备以下性能：1、分子较小，可携带比较大的DNA片段。 2、能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。 3、要有尽可能多种限制酶的 切割位点，但每一种限制酶又要最少的切割位点（多克隆位点 multiple cloning sites，MCS） 。 4、有适合的标记，易于选择。 5、有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，并且尽可能是高效的表达。 6、从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。 质粒载体必须具备的基本条件是： 1、具有至少一个复制起点； 2、具有抗菌素抗性，以便为寄主细胞提供易于检测的表型性状做为选择信号，而且在有关的

17、限制酶位点上插入外源DNA后形成的质粒有一个选择标记； 3、具有若干限制酶切单一位点（MCS）； 4、具有较小的分子量和较高的拷贝数，低分子量的质粒易于操作，克隆外源片断后（不超过15kb）仍能有效的转化给受体细胞同时低分子量的质粒对限制酶具有多重识别位点的几率也较低；较高的拷贝数可获得大量的克隆基因。3、 氯化铯密度梯度离心的原理是什么？答：1、质粒DNA占总DNA的1%2%； 2、在细胞裂解及DNA分离过程中，大分子量的细菌染色体易断裂成线性片断，而质粒DNA分子量小，结构紧密仍保持完整的状态；染色剂溴化乙锭（EB）能掺入到DNA链的碱基中，导致链的解旋；而且形成的EB-DNA复合物中，E

18、B含量越高，密度会越低。3、 碱裂解法的原理是什么？解释其中相关试剂的作用？答：碱裂解法的原理： 1、共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA片断在拓扑学上存在差异； 2、pH值在12.012.5范围内时，线性的DNA会被变性而共价闭合环状质粒DNA却不会被变性； 3、在冷却或恢复中性pH值使DNA复性的过程中，线性染色体会形成网状结构，而cccDNA可以准确迅速复性，通过离心法去除线性染色体，获得含有cccDNA的上清液，用乙醇沉淀，便可以获得质粒DNA。相关试剂的作用： 葡萄糖：有利于PH的调节。 T ris-HCl ：缓冲液，调节PH。 EDTA：二价金属离子的少量存在，抑制核酸酶的活性

19、，从而保护质粒DNA免被降解。 NaOH：提供高的PH环境，使线性缺口的质粒DNA和线性的染色体DNA片段被选择性地变性。 SDS：使细胞裂解，释放出质粒及染色体的DNA。 醋酸钠：降低反应混合物的PH值，起到了中和作用，使现行的质粒及染色体DNA复性，并聚集成不可溶的网络聚合物；同时，高浓度的醋酸钠亦会引起蛋白质-SDS复合物和高分子量的RNA分子发生沉淀。 苯酚：抽提去除蛋白质污染物。 乙醇：沉淀并收集质粒DNA。5、表达型的质粒载体有什么特点？体外转录克隆基因的质粒载体和穿梭质粒载体各有什么特点？答：表达性的质粒载体的特点：待表达的真核基因编码序列被克隆在紧挨于启动子下游的多克隆位点上，

20、而且必须是其编码的蛋白质氨基末端这一头靠近启动子方向插入，才能在启动子控制下进行有效的转录。体外转录克隆基因的质粒载体的特点：在pUC质粒载体的基础上，有来自噬菌体的启动子，即T7启动子和SP6启动子，为RNA聚合酶的附着作用提供特异的识别位点。穿梭质粒载体的特点：具有两种不同复制起点和选择记号，可在两种不同的寄主细胞存活和复制。6、ColE 1质粒载体有什么特点？答：ColE 1质粒载体的特点如下：多拷贝的质粒，能产生细菌素，但含有对细菌素的免疫基因，在其分子结构上对核酸内切限制酶EcoR I也只存在有一个识别位点，这种质粒除了编码有大肠杆菌E1基因之外，为了其自身存活的需要，还编码有使寄主

21、细胞具有对大肠杆菌素E1免疫性的基因。7、pBR322质粒载体有什么特点？答：pBR322质粒载体的特点如下：（1）具有较小的分子量：它的分子量为4363bp。克隆载体的分子量大小不要超过10kb。（2）具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。（pBR322 DNA分子中总共有24种核酸内切酶只具有单一的酶切识别位点。其中7种内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部，2种识别位点在于这个基因的启动区内，所以9个限制酶切位点插入外源片断可以导致tetr基因的失活；另外有3种限制酶在氨苄青霉素抗性基因有单一的识别位点。）（3）具有较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后每个细胞中可积累1000300

22、0个拷贝。8、pUC质粒载体有什么特点？答：pUC质粒载体的特点如下：第一：具有较小的分子量和更高的拷贝数： 仅保留了pBR322的氨苄青霉素抗性基因和复制起点；在操作过程中复制起点内部发生了自发突变造成了基因rop的缺失，它是控制质粒的特殊因子，从而使拷贝数增加，平均每个细胞500700个拷贝。第二：适用于组织化学检测重组体： 具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ基因，所编码的-肽链可参与-互补作用，用X-gal显色对重组子进行鉴定，而pBR322质粒的重组子要进行两步的选择。（补充：蓝白筛选：lacZ基因编码-半乳糖苷酶的肽链，即其N端，可以与宿主细胞中的C端互补形成完整的-半乳糖苷酶互

23、补作用，-半乳糖苷酶可以在X-gal和IPTG的作用下产生蓝色物质，形成蓝色菌落）第三：具有多克隆位点MCS区段 方便具有不同粘性末端的外源片断的插入。第五章 噬菌体载体和柯斯载体一、举例说明噬菌体载体的载体类型。其中cos位点的作用是什么？ 噬菌体载体的主要类型1、插入式载体n 一种只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点的 派生载体。只能插入较小分子量的外源（10kb），广泛用于cDNA及小片段DNA的克隆n cI基因插入失活 如gt10、NM1149等载体，在cI基因上有EcoR I及Hind III的酶切位点。外源基因插入后将导致cI基因的失活。cI基因失活后将导致噬菌体不能溶源化，产生

24、清晰的噬菌斑。相反，产生混浊的噬菌斑。 n Lac Z基因插入失活：如charon16A，gt 11载体，在非必需区段引入lac Z基因，在lac Z基因上有EcoR位点，插入失活后利用X-gal法筛选（兰白筛选）。2、替换型载体（取代型载体）n 具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的DNA区段可以被外源插入的DNA片段所取代。可以克隆较大分子量的外源，克隆高等真核生物DNAn Charon 4A载体是用Lac 5（乳糖操纵子的大部分系列，包括完整的Lac Z）替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac 5作为选择标记.使用时用EcoRI水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体外进行重组、包装。而后

25、，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解E.coli，形成空斑n NM781:在NM781替换型载体中，可取代的EcoR片段，编码有一个supE基因（大肠杆菌突变体tRNA基因），这种NM781噬菌体感染细胞后，寄主细胞lacZ基因的琥珀突变被抑制，因此能在X-gal琼脂培养基上产生出蓝色的噬菌斑。如果这个具有supE基因的EcoR片段被外源DNA取代了，那么所形成的重组体噬菌体，在上述指示培养基上只能产生出无色的噬菌斑3.凯伦噬菌体载体 在噬菌体基础上发展起来的，既有插入型又有替换型；在基因工程实验中的用途十分广泛 承受外源DNA的能力：几个kb到23kb cos位点的两个作用：(

26、1)使进入细菌的DNA分子成为环状 ，这是插入细菌基因组的先决条件。(2)作为识别位点，由内切酶将滚环复制的多联体DNA切开二、简述重组体DNA的体外包装过程，并说明可容纳外源基因的大小？ 1.重组体DNA的体外包装：在A蛋白（有终止复制功能），E蛋白（是包装蛋白），D蛋白（是插入蛋白）共同作用下使重组体DNA转入头部。在体外试管中完成上述反应，利用D基因突变和E基因突变。n E基因琥珀突变（Eam）不能形成任何头部，积累大量的尾部n D基因琥珀突变（Dam），重组体DNA不能进入头部，成熟作用在头部前体阶段被终止，因而它感染的宿主中有大量头部前体蛋白积累。n 使用具有c857突变基因的噬菌体

27、的溶源大肠杆菌：BHB2690（Dam）和BHB2685（Eam）菌株培养获得头部和尾部n c857是温度敏感性阻遏基因，32为溶源状态，4445诱发，溶菌的S基因突变，因而不会溶菌。n 大量收集头部尾部蛋白，在体外与重组DNA包装2.由于噬菌体包装时，当DNA的长度短于野生型的75%或超过105%时，噬菌体的活性就急剧下降。因此只包装它的野生型DNA（48KB）的75%105%左右的，要求载体DNA和外源DNA长度上限是51kb，必需基因为28kb，外源极限在23kb。三. 柯斯质粒载体的特点1、具有噬菌体的特性； 插入合适长度外源基因后，可以在体外被包装成噬菌体，可以高效的感染大肠杆菌，进

28、入细胞后环化，并且不形成子代噬菌体2、具有质粒载体的特性； 含有质粒复制子，进入寄主后可以象质粒一样复制， 抗菌素抗性标记可以进行筛选 3、具有较高容量的克隆能力； 分子量较小，一般4-6kb，因此插入的载体上并且可以被成功包装的外源可以达到45kb 最低极限，如果柯斯质粒有5kb，外源必需要至少30kb 4、具有与同源性序列的质粒进行重组的能力 在同一个宿主中的柯斯质粒和质粒会形成共合体。 四. M13载体系列的优点1、在这类载体的基因组中有一条饰变的-半乳糖苷酶基因片段（Hind片段），其中插入了一段具有密集的多克隆位点的序列；2、M13载体系列是应用基因工程技术成对地构建的，可有效地克隆

29、双链DNA分子中的每一条链。 (1)具有多克隆位点(MCS)，方便克隆。 (2)许多M13载体的多克隆位点与质粒载体pUC序列的多克隆位点是相同的，在克隆位点选择上更为方便。3、可以定向地克隆DNA片段 克隆在M13 RF DNA分子上的双链DNA片段，到了子代噬菌体便成了单链的形式。所以如果要同时分离分子中的双链，则需要两种独立的克隆。根据M13的生物学特性知道，M13子代噬菌体中总是只含有（）链，所以M13载体克隆的外源DNA片段在子代噬菌体中究竟是含有DNA分子中的哪条链，则完全取决于外源克隆时的取向。这样一来，为分别分离外源分子的两条链带来一定的麻烦，解决这一问题的一个行之有效的方法就是定向克隆技术五. 噬菌粒载体的特点n 具有质粒的复制起点、选择性标记、多克隆位点等，方便DNA的操作，可在细胞内稳定存在；n 具有单链噬菌体的复制起点，在辅助噬菌体帮助下，可进行噬菌体的繁殖，产生单链的子代噬菌体。辅助噬菌粒载体特点