检验免疫学1-小吞

1、郭金华 讲授TelTel教研室在实验楼教研室在实验楼301301室室实验目的：实验目的： 1.1.掌握中性粒细胞吞噬功能试验的原理掌握中性粒细胞吞噬功能试验的原理 2.2.熟悉中性粒细胞吞噬功能试验的方法熟悉中性粒细胞吞噬功能试验的方法 3.3.了解巨噬细胞吞噬功能试验的原理和方法了解巨噬细胞吞噬功能试验的原理和方法实验项目：实验项目：1.1.中性粒细胞吞噬功能试验（讲解、操作）中性粒细胞吞噬功能试验（讲解、操作）2.2.巨噬细胞吞噬功能试验（了解）巨噬细胞吞噬功能试验（了解）一、原理一、原理 中性粒细胞（小吞噬细胞）富含溶酶体、过氧中性粒细

2、胞（小吞噬细胞）富含溶酶体、过氧化物酶及杀菌物质，具有吞噬细菌和异物颗粒的能化物酶及杀菌物质，具有吞噬细菌和异物颗粒的能力。在体外将中性粒细胞与细菌或异物颗粒共同孵力。在体外将中性粒细胞与细菌或异物颗粒共同孵育后，显微镜观察可见中性粒细胞内有细菌或异物育后，显微镜观察可见中性粒细胞内有细菌或异物颗粒。该试验常用颗粒。该试验常用白色葡萄球菌白色葡萄球菌作为中性粒细胞的作为中性粒细胞的吞噬物。吞噬物。 计算吞噬有细菌或异物颗粒的中性粒细胞数占计算吞噬有细菌或异物颗粒的中性粒细胞数占中性粒细胞总数的百分率和每个中性粒细胞平均吞中性粒细胞总数的百分率和每个中性粒细胞平均吞噬的细菌或异物颗粒数，可反映中

3、性粒细胞的吞噬噬的细菌或异物颗粒数，可反映中性粒细胞的吞噬功能。功能。二、材料二、材料* * 器材：无菌采血针、吸管、试管、玻片、显微镜、器材：无菌采血针、吸管、试管、玻片、显微镜、 水浴箱等水浴箱等* * 试剂：加热杀死的白葡菌悬液（试剂：加热杀死的白葡菌悬液（1010亿亿/ml/ml）、）、 3.83.8枸橼酸钠溶液或肝素溶液（枸橼酸钠溶液或肝素溶液（50U/ml50U/ml）、）、 瑞氏染液、瑞氏染液、7575酒精等酒精等三、方法三、方法1.1. 左手无名指消毒后，用无菌采血针取血左手无名指消毒后，用无菌采血针取血4 4滴（约滴（约0.2ml0.2ml），或），或从静脉采血从静脉采血6

4、68ml8ml，加入枸橼酸钠（或肝素）抗凝管中，摇，加入枸橼酸钠（或肝素）抗凝管中，摇匀。（枸橼酸钠：血匀。（枸橼酸钠：血1 1：4 4）2.2. 于上述管中加入白葡菌悬液于上述管中加入白葡菌悬液2 2滴（约滴（约0.1ml0.1ml）或）或3 34ml4ml，充分，充分混匀，置混匀，置3737水浴箱中孵育水浴箱中孵育30min30min，每，每10min10min轻摇一次。轻摇一次。3.3. 取出后略加振摇，用毛细吸管吸取，滴取出后略加振摇，用毛细吸管吸取，滴1 1滴于洁净载玻片上，滴于洁净载玻片上，用另一载玻片推成薄涂片，自然晾干后作瑞氏染色：用另一载玻片推成薄涂片，自然晾干后作瑞氏染色：

5、1)1) 滴加滴加WrightWright染色液（甲液）染色染色液（甲液）染色 1 12min2min；2)2) 滴加等量的缓冲液（乙液）染色滴加等量的缓冲液（乙液）染色 4 46min6min；3)3) 用水冲洗：平持玻片，在一端加水，使染料漂走；用水冲洗：平持玻片，在一端加水，使染料漂走；4)4) 自然干燥或滤纸印干后镜检。自然干燥或滤纸印干后镜检。三、方法三、方法4. 4. 先用低倍镜观察涂片全貌，换用油镜，辨认血细胞。中性粒先用低倍镜观察涂片全貌，换用油镜，辨认血细胞。中性粒细胞的核和被吞噬细菌呈紫色，中性粒细胞的胞浆呈淡红色。细胞的核和被吞噬细菌呈紫色，中性粒细胞的胞浆呈淡红色。5.

6、 5. 计数计数100100个中性粒细胞，分别记录发生吞噬和未发生吞噬的中个中性粒细胞，分别记录发生吞噬和未发生吞噬的中性粒细胞数，同时记录所吞噬的细菌数。（越接近推片末梢，性粒细胞数，同时记录所吞噬的细菌数。（越接近推片末梢，细胞数越多。计数时应取血涂片前、中、后三段计数，以提细胞数越多。计数时应取血涂片前、中、后三段计数，以提高准确率。）高准确率。） 6. 6. 结果：结果：1)1) 吞噬率有吞噬细菌的细胞数吞噬率有吞噬细菌的细胞数/100/100个中性粒细胞个中性粒细胞2)2) 吞噬指数被吞噬的细菌数吞噬指数被吞噬的细菌数/100/100个中性粒细胞个中性粒细胞正常情况下，中性粒细胞吞噬

7、率约为正常情况下，中性粒细胞吞噬率约为80809090，吞噬指数大于，吞噬指数大于1 1。左上：瑞氏染色左上：瑞氏染色 右下：革兰染色右下：革兰染色血细胞血细胞嗜中性粒细胞（neutrophilic granulocyte）中性杆状核粒细胞嗜中性粒细胞（neutrophilic granulocyte） 杆状核细胞（杆状核细胞（NstNst）：胞体直径）：胞体直径101015m15m，圆形。胞核凹陷程度，圆形。胞核凹陷程度与假设核直径之比大于与假设核直径之比大于1/21/2，或凹陷程度与假设圆形核直径之比大于，或凹陷程度与假设圆形核直径之比大于3/43/4，形态弯曲呈粗细均匀的带状，也可见核呈

8、，形态弯曲呈粗细均匀的带状，也可见核呈S S形、形、U U形或形或E E形，核染形，核染色质粗糙呈块状，副染色质明显、透亮，核两端钝圆呈深紫红色。胞色质粗糙呈块状，副染色质明显、透亮，核两端钝圆呈深紫红色。胞质中充满中性颗粒而无质中充满中性颗粒而无A A颗粒。颗粒特点：大小一致、分布均匀、细小颗粒。颗粒特点：大小一致、分布均匀、细小中性。中性。 分叶核细胞分叶核细胞(Nsg)(Nsg)：胞体直径：胞体直径101014m14m，圆形。胞核分叶状，常，圆形。胞核分叶状，常分分2525叶，叶与叶之间有细丝相连或完全断开，有时核虽分叶但叠在一叶，叶与叶之间有细丝相连或完全断开，有时核虽分叶但叠在一起，

9、致使连接的核丝被隐蔽，这时核常有粗而明显的切痕；核染色质起，致使连接的核丝被隐蔽，这时核常有粗而明显的切痕；核染色质呈较多小块，深紫红色，副染色质明显。胞质丰富，呈淡红色，浆内呈较多小块，深紫红色，副染色质明显。胞质丰富，呈淡红色，浆内充满中性颗粒。分叶核粒细胞和杆状核粒细胞的另一种划分标准是核充满中性颗粒。分叶核粒细胞和杆状核粒细胞的另一种划分标准是核桥（即核最窄处小于最宽处的桥（即核最窄处小于最宽处的1/31/3）。）。嗜酸性粒细胞（eosinophilic granulocyte）胞体直径1116m，圆形。杆状核与嗜中性杆状核粒细胞相似，分叶核多分为2叶，胞质中充满嗜酸性颗粒。颗粒特点：

10、大小一致、分布均匀、粗大、嗜酸性。颗粒特点：大小一致、分布均匀、粗大、嗜酸性。嗜酸性分叶核粒细胞嗜酸性杆状核粒细胞嗜碱性粒细胞（basophilic granulocyte）嗜碱性杆状核粒细胞胞体直径胞体直径1012m，以分叶居多，可分为，以分叶居多，可分为34叶或分叶不明显（常融合成堆集状）。叶或分叶不明显（常融合成堆集状）。胞质内及核上有少许嗜碱性颗粒，浆呈红色。胞质内及核上有少许嗜碱性颗粒，浆呈红色。颗粒特点：大小不一、分布不均、嗜碱性强颗粒特点：大小不一、分布不均、嗜碱性强粒细胞区分要点（特殊颗粒）粒细胞区分要点（特殊颗粒） 中性颗粒中性颗粒 嗜酸性颗粒嗜酸性颗粒 嗜碱性颗粒嗜碱性颗粒

11、 嗜苯胺蓝颗粒嗜苯胺蓝颗粒 大小大小 细小细小 大小一致大小一致 粗大粗大 大小一致大小一致 最粗大最粗大 大小不一大小不一 较中性颗粒粗大较中性颗粒粗大 大小不一大小不一 形态形态 细颗粒状细颗粒状 圆形或椭圆形似小珠圆形或椭圆形似小珠 形态不一形态不一 形态不一形态不一 数量数量 多多 多多 不一定，常不多不一定，常不多 少量或中等量少量或中等量 色泽色泽 淡紫红色淡紫红色或淡红色或淡红色 橘红色或暗黄色橘红色或暗黄色 深紫红色或深紫深紫红色或深紫黑色黑色 紫红色紫红色 分布分布 均匀均匀 均匀均匀 分布不一分布不一 常覆盖在核上常覆盖在核上 分布不一分布不一 有时覆盖核上有时覆盖核上 淋

12、巴细胞淋巴细胞(lymphocyte(lymphocyte） 大淋巴细胞：胞体直径大淋巴细胞：胞体直径121215m15m，圆形或类圆形。胞核椭圆形，常，圆形或类圆形。胞核椭圆形，常偏一侧；核染色质紧密而均匀，染呈深紫红色；核仁消失、有时隐约可见偏一侧；核染色质紧密而均匀，染呈深紫红色；核仁消失、有时隐约可见假核仁。胞质较多，呈清澈的淡蓝色，常有少许嗜天青颗粒。假核仁。胞质较多，呈清澈的淡蓝色，常有少许嗜天青颗粒。 小淋巴细胞：血液中多为小淋巴细胞胞体直径小淋巴细胞：血液中多为小淋巴细胞胞体直径6 69m9m，圆形、类圆，圆形、类圆形或蝌蚪形等。胞核类圆形或有小切迹；核染色质紧密呈大块状，副染

13、色形或蝌蚪形等。胞核类圆形或有小切迹；核染色质紧密呈大块状，副染色质不明显（结块的边界不清楚），染呈深紫红色；核仁消失、有时隐约可质不明显（结块的边界不清楚），染呈深紫红色；核仁消失、有时隐约可见假核仁。胞质极少（颇似裸核），呈淡蓝色，常无颗粒，有时可见胞质见假核仁。胞质极少（颇似裸核），呈淡蓝色，常无颗粒，有时可见胞质突起。突起。单核细胞单核细胞(monocyte)(monocyte)血小板胞体直径胞体直径1220m，圆形或不规则，常可见伪足。胞，圆形或不规则，常可见伪足。胞核不规则，常呈肾形、大肠状、马蹄形、核不规则，常呈肾形、大肠状、马蹄形、S形、分叶形、形、分叶形、笔架形等；核染色质疏

14、松，可呈条索状、小块状。胞质笔架形等；核染色质疏松，可呈条索状、小块状。胞质量多，呈灰蓝色或灰红色、半透明如毛玻璃样；胞浆内量多，呈灰蓝色或灰红色、半透明如毛玻璃样；胞浆内见细小、分布均匀的灰尘样紫红色颗粒，常有空泡。见细小、分布均匀的灰尘样紫红色颗粒，常有空泡。一、原理一、原理 巨噬细胞吞噬现象又称为大吞噬现象。如在小鼠腹腔内注入巨噬细胞吞噬现象又称为大吞噬现象。如在小鼠腹腔内注入鸡红细胞，腹腔巨噬细胞会吞噬鸡红细胞，并进一步将其消鸡红细胞，腹腔巨噬细胞会吞噬鸡红细胞，并进一步将其消化。取小鼠腹腔液涂片，在显微镜下可见鸡红细胞被吞噬的化。取小鼠腹腔液涂片，在显微镜下可见鸡红细胞被吞噬的现象。

15、据此可了解巨噬细胞的吞噬功能。现象。据此可了解巨噬细胞的吞噬功能。二、方法二、方法1.1.实验前一天，于小鼠腹腔内注射灭菌淀粉肉汤培养基实验前一天，于小鼠腹腔内注射灭菌淀粉肉汤培养基1ml1ml。2.2.实验当天，小鼠腹腔内注入实验当天，小鼠腹腔内注入5 5鸡红细胞悬液鸡红细胞悬液0.50.51ml1ml。轻柔腹部，。轻柔腹部，使鸡红细胞分散。使鸡红细胞分散。3.3.30min30min后，腹腔内注入后，腹腔内注入HankHanks s液液2ml2ml，轻揉腹部，然后吸取腹腔液注，轻揉腹部，然后吸取腹腔液注入盛有入盛有1ml Hank1ml Hanks s液（内含肝素液（内含肝素10U10U）

16、试管中，）试管中，3737静置静置30min30min，以，以1500r/min1500r/min离心离心10min10min。4.4.取沉淀物作涂片，自然干燥，瑞氏染色，镜检，计数。取沉淀物作涂片，自然干燥，瑞氏染色，镜检，计数。5.5.结果：结果：1)1) 吞噬率有吞噬鸡红细胞的细胞数吞噬率有吞噬鸡红细胞的细胞数/100/100个巨噬细胞个巨噬细胞2)2) 吞噬指数被吞噬的鸡红细胞数吞噬指数被吞噬的鸡红细胞数/100/100个巨噬细胞个巨噬细胞 正常情况下，巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬率约为正常情况下，巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬率约为606065%65%， 吞噬指数接近吞噬指数接近1 1。巨

17、噬细胞巨噬细胞核呈核呈蓝色蓝色,鸡红细胞鸡红细胞呈椭圆形呈椭圆形,其其胞浆呈胞浆呈红色红色而而核核被染成蓝被染成蓝色色。一、光学显微镜的结构一、光学显微镜的结构机械系统光学系统二、重要的参数：二、重要的参数：1.1.工作距离：视野清晰时，物镜与标本间的距离。工作距离：视野清晰时，物镜与标本间的距离。1)1) 低倍镜：约低倍镜：约6.56.52)2) 高倍镜：约高倍镜：约0.60.63)3) 油镜：约油镜：约0.20.22.2.焦点深度：物镜的倍数越大，焦点深度越浅。焦点深度：物镜的倍数越大，焦点深度越浅。3.3.分辨力：一般的光学显微镜的最高分辨力为分辨力：一般的光学显微镜的最高分辨力为0.2

18、0.2三、油镜的使用和维护：三、油镜的使用和维护：（1 1）在标本片的镜检部位加）在标本片的镜检部位加1 1滴液体石蜡（或香柏油），放在载滴液体石蜡（或香柏油），放在载物台上并固定好；物台上并固定好；（2 2）眼睛从侧面注视镜头，轻轻转换）眼睛从侧面注视镜头，轻轻转换油镜油镜，调整使镜面浸在油滴，调整使镜面浸在油滴中，并轻轻与标本接触。中，并轻轻与标本接触。（3 3）调光：调整光源强弱、聚光器高度、光圈大小，从接目镜内）调光：调整光源强弱、聚光器高度、光圈大小，从接目镜内观察，使视野光线充足明亮；观察，使视野光线充足明亮；（4 4）调焦：旋转粗准焦螺旋，缓慢拉开物镜与标本间的距离，同）调焦：旋转粗准焦螺旋，缓慢拉开物镜与标本间的距离，同时注意观察视野，当出现一闪而过的物像时，稍微用细准焦时注意观察视野，当出现一闪而过的物像时，稍微用细准焦螺旋回调即可见到清晰的视野；螺旋回调即可见到清晰的视野；（5 5）如果油镜已离开油面仍未见物像，不能直接回调寻找，必须）如果油镜已离