药实验四：线粒体和细胞核的制备与观察教学内容

1、药实验四：线粒体和细胞核的制备与观察 细胞器标记酶的测定是评价细胞器内膜组分和分离纯度的主要依据，如线粒体内膜上分布有细胞色素氧化酶，该酶使詹纳斯绿B染料保持在氧化状态呈现蓝绿色，从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。 詹纳斯绿B是一种活体染料，能对动植物的细胞或组织在活体状态下进行无毒害的染色。由于染料（碱性染料）的胶粒表面带有阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子，而被染部分本身具有阳离子或阴离子，这样，它们彼此之间发生吸引作用，染料就被堆积下来。染色法可以显示出活细胞内的某种天然结构存在的真实性，且不影响细胞的生命活动。Gimesa是一种复合染料，即为酸性染料与碱性染料的结合物。在

2、水溶液中电离为带正电和负电的染料离子。 三、实验材料、用品三、实验材料、用品1. 器材： 解剖刀，剪刀，漏斗，玻璃匀浆器玻璃匀浆器，尼龙织物，离心管，显微镜，冷冻高速离心机等。2. 材料： 兔肝脏, 玉米黄化苗3. 试剂：(1) 0.25mol/L蔗糖-0.01mol/L三羟甲基氨基甲 烷(Tris)-盐酸缓冲液(pH7.4)(2) 1%詹纳斯绿B(Janus green B)染液。(3) 姬姆萨染液（Giemsa）。(4) 1/15 mol/L磷酸缓冲液（pH6.8）(5) 卡诺（Cornay）固定液。(6) 生理盐水四、实验步骤四、实验步骤( (一一) ) 兔肝细胞线粒体及细胞核的分离兔肝

3、细胞线粒体及细胞核的分离 （动物材料）1.制备肝细胞匀浆： 实验前将白兔空腹12小时，脱臼处死，剖腹取肝，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干水，称取肝组织0.3g，剪碎；用预冷的0.25mol/L蔗糖溶液洗涤数次。然后加1.5 ml预冷的0.25mol/L蔗糖溶液，分数次添加蔗糖溶液，冰浴中用玻璃匀浆器将肝制成匀浆，肝匀浆用双层纱布过滤(滤液制两张涂片滤液制两张涂片).涂片过程：涂片过程：3. 3. 分离物鉴定：分离物鉴定：（1 1） 细胞核：将涂片细胞核：将涂片（不加盖玻片）（不加盖玻片）自然干燥后自然干燥后加入加入CarnoyCarnoy固定液固定液15min15min，晾干。，晾干。Gi

4、emsaGiemsa染液染染液染10min10min，蒸馏水漂洗数秒，用滤纸吸干水，用显微镜（蒸馏水漂洗数秒，用滤纸吸干水，用显微镜（4040）检）检查，查，细胞核呈紫红色，混杂的细胞质为浅蓝色碎片。细胞核呈紫红色，混杂的细胞质为浅蓝色碎片。（2 2） 线粒体：取线粒体沉淀滴在载玻片上，得涂片线粒体：取线粒体沉淀滴在载玻片上，得涂片，勿太密。滴加，勿太密。滴加1-21-2滴滴1%1%詹纳斯绿詹纳斯绿B B溶液染色，溶液染色，1010分分钟后钟后加盖玻片，吸水纸吸走多余染料，加盖玻片，吸水纸吸走多余染料，用光学显微镜观用光学显微镜观察，察，线粒体呈蓝绿色，小棒状或哑铃状。线粒体呈蓝绿色，小棒状或

5、哑铃状。( (二二) ) 玉米线粒体及细胞核的分离玉米线粒体及细胞核的分离（植物材料）（植物材料） 从植物细胞分离线粒体，除了作线粒体功能研究外，在植物细胞遗传工程中，常用于分离核外基因线粒体DNA等目的。 分离线粒体的方法仍采用均匀介质中的差数离心。介质中0.25mol/L蔗糖也可以用0.3mol/L甘露醇代替。EDTA螯合二价阳离子，Ca2+除去后细胞间粘着解体，促使组织分散成单个细胞。牛血清白蛋白（BSA）能包在细胞外面，并作为竞争性底物削弱蛋白酶的作用。1.试剂1）分离介质：0.25mol/L蔗糖，50mmol/L的 Tris-HCl缓冲液（pH7.4），3 mmol/L EDTA，0

6、.75 mg/ml BSA。2）保存液：0.3 mol/L 甘露醇（pH7.4）。 3）20% NaClO溶液。4）1% 詹纳斯绿B染液，用生理盐水配制。2.器材剪刀，漏斗，研钵研钵，纱布，离心管，显微镜，冷冻高速离心机等。 3.实验方法1）剪取12cm长的幼苗黄化苗0.5g，剪碎；加2.0 ml预冷的分离介质，冰浴上研磨成匀浆。2）匀浆用双层纱布过滤(滤液制两张涂片滤液制两张涂片).3）滤液700g离心10分钟，除去核和杂质沉淀。4）上清夜10000g离心15分钟，沉淀为线粒体制涂片制涂片5）涂片未干时，立即滴加1% 詹纳斯绿B染液，染色10分钟，盖上盖玻片盖上盖玻片，用显微镜观察，线粒体是蓝绿色圆形颗粒。五、实验结果五、实验结果光学显微镜观察，线粒体呈蓝绿色，小棒状或光学显微镜观察，线粒体呈蓝绿色，小棒状或哑铃状。哑铃状。 六、实验报告六、实验报告1.分别描述2张细胞核涂片的结果(如平均每个视野中 所见完整的细胞核数量，完整的细胞或带有残留细 胞质的细胞核的约占多少等)2.分别描述鼠和水稻黄化苗的两张线粒体装片的观察 结果,根据你的实验结果,你认为所分离的线粒体的 纯度如何?3.绘图：动物材料涂片绘图：动物材料涂