离体微繁技术

1、引 言微繁的一般方法微繁中存在的问题一、引言 组织培养技术作为植物营养繁殖的一个新手段目前正在日益普及。这种通过无菌方法进行的无性繁殖现在通称通过无菌方法进行的无性繁殖现在通称为为“微繁微繁”，它可以用较短的时间和较少的空间，由一个个体开始产生大量的植株。 植物离体微繁的突出优点就是快速，而且材料来源单植物离体微繁的突出优点就是快速，而且材料来源单一，遗传背景较为一致不受季节和地区等限制，重复性好一，遗传背景较为一致不受季节和地区等限制，重复性好。离体快繁比常规方法快数万倍甚至百万倍。目前世界上已建成许多年产百万苗木的组织培养工厂，已成为一个新兴产业并国际化。离体快繁方法已在观赏植物、园艺植物

2、、经济林木、无性繁殖作物等广泛应用。文心兰快繁文心兰快繁石斛离体快繁石斛离体快繁二、微繁的一般方法 微繁通常包括四个步骤：q 无菌培养物的建立无菌培养物的建立q 茎芽的增殖茎芽的增殖q 离体形成枝条进行生根离体形成枝条进行生根q 植株驯化移栽植株驯化移栽（一） 无菌培养物的建立1. 外植体 在一定程度上，用于离体繁殖的外植体的性质，是由所要采用的茎芽繁殖方式决定的。（1）取材部位取材部位 为了增加生枝的数目，应当使用带有营养芽的外植体；为了从受病毒病感染的个体生产脱毒苗，就必须使用不足1mm长的茎尖分生组织作外植体。倘若母株是无毒的，最适合的外植体是带节的插条。小的茎尖外植体不但存活率不高，初

3、期生长很慢，而且还可能使某些园艺性状消失。 （2）取材方式取材方式 在生长季节由活跃生长的枝条上切取的外植体，通常能产生最好的效果。若把供体植株种在温室或生长箱中，使它们保持在连续进行营养生长所需的光照和温度条件下，有可能把茎芽对培养反映的季节性波动减少到最低限度。（3）预处理预处理 对于需要低温、高温或特殊的光周期才能打破休眠的鳞茎、球茎、块茎和其他器官，应当灭菌消毒之前进行必要的处理。由经过11冷处理68周的水仙鳞茎上切取的茎尖，比由未经处理的鳞茎上切取的茎尖在离体培养中生长快，存活率高。2. 消毒 在茎段和顶芽的培养中，污染的机会较多，若在去掉几层老叶之后切取0.51mm的茎尖进行培养，

4、污染的机会就会减少。对于包在很多成熟叶片中的茎尖或是鳞茎中央的鳞片来说，只要把芽或鳞茎用70酒精擦拭消毒，并小心地剥掉外层结构，解剖出来即是无菌的。用自来水把植物材料冲洗2030min，可以显著减少微生物区系的群体数量。 消毒方法可参照外植体常规消毒方法。（二） 茎芽增殖的三种途径1. 愈伤组织愈伤组织 利用植物细胞在培养中无限增殖的可能性以及它们的全能性，可以对若干种植物类型进行快速繁殖。在培养细胞中通过器官发生或体细胞胚胎发生在培养细胞中通过器官发生或体细胞胚胎发生都可以分化出植株都可以分化出植株。在能够适用的情况下，由愈伤由愈伤组织分化发生器官常常是进行植物繁殖的最快方法组织分化发生器官

5、常常是进行植物繁殖的最快方法。用愈伤组织培养进行植物繁殖的缺点：（1）细胞在染色体数目等遗传上的不稳定性细胞在染色体数目等遗传上的不稳定性。（2）随着继代保存时间的增加愈伤组织最初表现的植株随着继代保存时间的增加愈伤组织最初表现的植株再生能力可能逐渐下降，最后甚至完全丧失再生能力可能逐渐下降，最后甚至完全丧失。 对于某些重要的物种如柑桔、咖啡、小苍兰和棕榈来说，愈伤组织是目前进行离体营养繁殖的唯一方法。2. 不定芽形成 凡是在腋芽或茎尖以外任何其他地方形成的芽统称为不定芽，有愈伤组织分化形成的茎芽也是不定芽。 若干种植物，如悬钩子、风信子、秋海棠等在活体的情况下即能由根、鳞茎和叶等不同的器官产

6、生不定芽，在离体培养的条件下，这些植物产生不定芽的频率可以显著提高。风信子（Hyacinthus orientalis）3. 增强腋芽生枝能力 腋芽存在于每个叶片的叶腋中，腋芽存在于每个叶片的叶腋中，每个腋芽都有发育成一个枝条的能力每个腋芽都有发育成一个枝条的能力。在自然情况下，腋芽可以在长短不同在自然情况下，腋芽可以在长短不同的时间内保持休眠的时间内保持休眠。这种顶端优势现象是由几种生长调节物质的互作控制的。 为什么在腋芽生枝可用在离体快繁中？为什么在腋芽生枝可用在离体快繁中？ 传统的通过插条进行营养繁殖的方法，是利用在不存在顶芽的情况下，腋芽具有取代主茎功能的能力，但一年中由一个植株上所能

7、得到的插条数目极为有限。 当把小枝条放在含有适当浓度细胞分裂素适当浓度细胞分裂素的培养基上培养，可增强腋芽生枝能力，使枝条的繁殖系数显著提高。形成的枝条就会长出腋芽，这些腋芽又可以直接发育成枝条。（三）离体形成的枝条进行生根 在细胞分裂素存在的情况下，由不定芽和腋芽长成的枝条一般都没有根。为了得到完整的植株，必须把枝条转到生根培养基中。生根培生根培养基中的盐浓度可减少到养基中的盐浓度可减少到1/2或或1/4，并减少或去，并减少或去除细胞分裂素，同时添加适量的生长素除细胞分裂素，同时添加适量的生长素。在进行生根处理时，要把大约6cm长的幼枝逐个剪下，转移到生根培养基中。 可以把有些植物在离体条件

8、下形成的枝条当可以把有些植物在离体条件下形成的枝条当作插条，使它们在土中生根作插条，使它们在土中生根。在这种情况下，须须把插条的基部切口先用标准的生根粉或把插条的基部切口先用标准的生根粉或IBA处理处理，然后再把它们种在花盆中然后再把它们种在花盆中。在可能的情况下，试管外生根由于减少了一个无菌操作步骤因而可降低成本。（四） 移栽 把植株由试管移栽入土，须小心分步进行。 1. 轻轻地洗掉粘在根上的琼脂培养基。 2. 移栽后，最初1015天要通过喷雾或罩上透明塑料以保持很高的湿度（90100%). 3. 在塑料罩上可打些小孔，以利气体交换。 4. 移栽时把小植株的一部分叶片剪掉也可能是有益的。 5

9、. 在保湿数天之后，可把植株搬入温室，但仍需遮荫数日。 移栽后要完成上述各个步骤可能需花费46周时间，此后即可让这些植株在正常的室温条件下生长。三、微繁中存在的问题（一）褐变 （browning）1. 褐变及其机理 在初代培养和继代培养中，我们经常会发现外植体或培养材料发生褐化和枯死现象，对诱导外植体愈伤组织的形成和器官分化产生不利影响，因此组织培养过程中外植体褐变是影响组织培养成功的重要因素。 褐变包括酶促褐变和非酶促褐变，目前认为植褐变包括酶促褐变和非酶促褐变，目前认为植物组织培养中的褐变主要由酶促引起物组织培养中的褐变主要由酶促引起。在合适的条件下，酚氧化酶催化酚类物质与氧气发生氧化反应

10、酚氧化酶催化酚类物质与氧气发生氧化反应。当切割和接种外植体时，机械损伤使得伤口细胞中当切割和接种外植体时，机械损伤使得伤口细胞中酚类物质被氧化成醌，醌再经非酶促聚合，使切面酚类物质被氧化成醌，醌再经非酶促聚合，使切面变成棕褐色或暗褐色变成棕褐色或暗褐色，这些褐色物会逐渐扩散到培养基中，对外植体组织产生毒害作用，影响其生长分化，甚至导致死亡。 2. 影响褐变的因素（1）植物种类及基因型 不同种植物、同种植物不同类型、不同品种在组织培养中褐变发生的频率及程度都有很大差异。褐变现象主要发生在木本植物、单宁或色素含量高褐变现象主要发生在木本植物、单宁或色素含量高的植物中，草本植物发生褐变的几率较小，的

11、植物中，草本植物发生褐变的几率较小，但是一些观赏植物如兰科的卡德兰属、兰属、观赏羽衣甘蓝、郁金香等也会发生褐变。因此，在植物组织培养中应尽量采用褐变程度轻的材料进行培养，以提高培养效率和增殖率。（2）外植体部位及母株生理状态 一般来说，茎比叶和根更容易诱导出愈伤组织，而且不一般来说，茎比叶和根更容易诱导出愈伤组织，而且不易褐变；顶芽比侧芽褐变程度要轻，而且容易成活易褐变；顶芽比侧芽褐变程度要轻，而且容易成活。成龄材成龄材料一般比幼龄材料更容易褐化料一般比幼龄材料更容易褐化。 褐变通常随着材料组织的木质化程度而增加，并且植物体内酚类物质含量和多酚氧化酶的活性呈季节性变化，春季较弱，而在生长季节则

12、活性增强。因此，取材时期不同，褐变程度也不同。一般都选在早春或秋季取材一般都选在早春或秋季取材。例如卡德兰新茎在旺盛生长的69月间褐变显著增加,在生长较弱的冬春季则明显减少。 （3）外植体受伤程度 一般而言，外植体越小，切面与体积的比率越一般而言，外植体越小，切面与体积的比率越大，所受伤害及褐变的程度也就越大大，所受伤害及褐变的程度也就越大。为了减轻褐为了减轻褐变，应尽可能减少外植体伤口面积，切口应该尽量变，应尽可能减少外植体伤口面积，切口应该尽量平整。平整。此外，消毒剂对外植体的伤害也会引起褐变消毒剂对外植体的伤害也会引起褐变，酒精对外植体伤害较重，而升汞对外植体伤害较轻。而且外植体消毒时间

13、越长，褐变程度也越严重，因此应该合理选择消毒剂，并掌握适宜的消毒时间，才能有效地提高外植体的成活率。（4）培养基 培养基中较高浓度的无机盐较高浓度的无机盐能够增加参与酚类合成与氧化酶类辅因子的活性，引起培养材料细胞中酚类物质的大量产生，导致外植体褐变。 培养基中高高pH值值可增加多酚氧化酶活性和酚类物质的利用率，从而促进褐变。 细胞分裂素类细胞分裂素类如BA或KT既能促进酚类化合物的合成，还能提高多酚氧化酶活性，而生长素类如2,4-D和IAA可减缓多酚合成，减轻褐变发生。（5）培养条件 培养条件不适宜，光照过强或培养温度过高光照过强或培养温度过高均能提高多酚氧化酶活性，导致培养材料褐变。 高浓

14、度高浓度CO2会导致细胞内膜系统自我降解，酚类物质与多酚氧化酶接触，促进褐变发生。 （6）培养时间 接种材料培养时间过长接种材料培养时间过长，未能及时转接到新鲜培养基上，使得培养基中褐变物质大量积累，也会引起材料的褐变，甚至导致全部死亡。 3. 防止褐变的措施（1）对母株的处理 对母株进行遮光处理，而且可以采用室内盆栽对母株进行遮光处理，而且可以采用室内盆栽，给予植株适宜的生长条件，促进幼嫩部位的生长，例如采自温室的茎段比采自田间的进行培养不易发生褐变。 （2）选取外植体 适宜在春季或秋冬季，从幼龄植株上选取顶芽或茎尖适宜在春季或秋冬季，从幼龄植株上选取顶芽或茎尖作为外植体作为外植体。此外，还

15、可以采用低温处理采用低温处理，将外植体在5下处理1224，均有助于减轻褐化。切割分离外植体时切割分离外植体时可以在抗氧化剂或吸附剂中进行可以在抗氧化剂或吸附剂中进行，用于切割的刀具最好比较锋利，以减少创伤面，使细胞伤害降到最低。 （3）预培养 初代培养时，先把外植体置于液体培养基中振荡培养把外植体置于液体培养基中振荡培养，当其诱导出愈伤组织，或出现器官分化时再转接到固体培养基上培养，这样有助于减少褐变，保证外植体培养的成功。（4）选择适宜的培养基及培养条件 降低培养基中无机盐的浓度降低培养基中无机盐的浓度能够减少酚类物质外溢，同时降低多酚氧化酶类的活性，有效抑制褐变。选择适宜的蔗糖浓度、激素配

16、比、培养基pH值以及培养方式也是十分重要的。此外，在初始培养把外植体处于黑暗、弱光条初始培养把外植体处于黑暗、弱光条件下培养件下培养，也可抑制酚类物质的氧化。（5）在培养基中加入抗氧化剂和吸收剂 抗氧化剂主要有抗坏血酸、半胱氨酸、柠檬酸、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等，多酚氧化酶（PPO）抑制剂主要有SO2、亚硫酸盐、NaCl等，它们都是褐变抑制剂，可减轻酚类物质的毒害。此外，0.1%0.5%活性炭对吸附酚类氧化物的效果也很明显。 （6）连续转移外植体 在外植体初代培养12天后，立即转移到新鲜培养基中，可减轻酚类物质对培养物的毒害作用，继代培养五六次即可基本消除外植体褐变问题。 （二）玻璃化现象1. 概念 在组织培养过程中，我们经常会发现不定芽丛或者试管苗畸形生长，茎叶呈半透明水渍状，叶片失绿、皱缩，并沿纵向卷曲，脆弱易碎，叶表面完全无蜡质，称之为“玻璃化现象”。 2. 表现 “玻璃苗”细胞丧失持水能力,细胞内水分大量外渗,增加了植株水分的散失和蒸腾,