聚合卵巢的肾囊移植手术操作

1、供体细胞的聚合操作青岛农业大学动物生殖发育与基因工程研究所陈波 flamingcb1、在聚合前，先平衡铺有琼脂的30mm培养皿：在培养皿中铺上一层薄薄的琼脂，待琼脂凝固后，向其中加入1ml 含10% FCS的MEM培养液，放入37、饱和湿度、5%CO2培养箱中。如此反复洗3次，每次15min以上。2、把待聚合的细胞混合均匀，转移到0.5ml离心管中（注意用BSA培养液洗下平皿中剩余的细胞），3500rpm，离心3min，弃上清。3、加入400l BSA培养液洗涤细胞（去除消化液），3500rpm，离心3min，弃上清，尽量把上清吸干净。4、加入BSA培养液100l重悬细胞，加入0.02g植物凝

2、集素，使其终浓度为0.2mg/ml，混匀。37、饱和湿度、5%CO2培养箱平衡10min，平衡过程中震荡数次以利于细胞充分吸附植物凝集素。5、12000rpm，离心10s，将离心管旋转180，12000rpm，离心30s。6、取一个200ul枪头，用刀片倾斜着削去一部分（就像注射器针尖的切面），以便能将组织完整吸入而不损伤其结构。把离心管中的组织块用枪吸到平衡好的30mm 培养皿中，加入适量含10% FCS的MEM培养液，在保证组织不至于悬浮在培养液中的前提下尽量多加一些这点很重要！将培养皿倒置放入37、饱和湿度、5%CO2培养箱培养。7、培养24h后的聚合卵巢会开始渐渐聚拢，形成圆饼状；培养

3、48h后的聚合卵巢则形成圆球形，明显高出培养液液面，边缘形成清晰的界面，用镊子可以反复夹起而不变形。聚合的卵巢一定要培养到供体有稳定的形状后再移植，否则在肾包囊的压力下供体会被压扁而无法成团，也就无法支持卵泡发生（这是血的教训）！8、聚合出的组织不能超过2mm3，否则营养无法输送到组织内部，在供体与受体建立起新的血管联系之前，供体内部会坏死！附件：植物凝集素的配制：1、试剂信息：索莱宝进口分装：P8090-5植物血球凝集素 PPHA-P Sigma 5mg2、5mg/ml植物凝集素储存液的配制： PHA-P 5mg 0.01M PBS（超纯水配制） 1ml配制时，直接向试剂管内加1mlPBS，

4、盖上盖子，反复颠倒数十下后静置数分钟待药品溶解，5000rpm离心10s。配好后用PCR管每管50l分装，4保存。使用浓度：0.2mg/ml（即每100l使用4l）。聚合卵巢的肾囊移植手术操作青岛农业大学动物生殖发育与基因工程研究所陈波 flamingcb1、选取8-12周大，体型适中，反应敏捷，正常发情且未合笼的健康母鼠作为受体。周龄偏小的小鼠其肾囊较脆弱，不利于植入操作。2、根据小鼠的体重，腹腔注射6mg/ml的戊巴比妥钠麻醉剂使小鼠麻醉，麻醉剂的用量为0.85mg/10g体重（一般为410ul-430ul，不会超过500ul）。使用avertin做麻醉剂时：成年CD-1母鼠用量为520u

5、l左右；成年CD-1公鼠为1ml左右；SCID Beige鼠用量在410左右。注射手法见下图：麻醉后有必要对麻醉效果进行评价：l 如果给小鼠剪毛和剪开皮肤时不会剧烈反抗（轻微放抗是正常的），眼睛、脚掌和尾巴血色充盈，则视为麻醉效果较好；l 如果麻醉效果不好，可视具体情况追加麻醉剂，补加麻醉剂最好在剪开腹膜之前进行；l 如果麻醉过度，则小鼠毫不反抗，并且全身血色渐渐退去，眼睛、脚掌和尾巴渐渐发暗，则视为麻醉过度，应放弃该受体，重新麻醉；l 如果麻醉后或手术过程中，小鼠呼吸困难（此时会做几次连续深度呼吸）、呼吸停止或排尿，则受体即将死亡。3、用酒精湿润小鼠背侧皮肤，以术剪减去小鼠背侧毛，范围为距切

6、口周围1cm为宜。4、在小鼠背侧中线与卵巢大概所处位置的水平线的交点处，沿脊柱由下至上纵向剪开一个1.5cm左右长的切口（不要太大，切口上缘可用于辅助固定牵出后的肾脏），直至小鼠脊柱背侧隆起，如下图绿线所示：5、用镊子撕开皮肤与腹膜之间的粘连，注意此时小鼠反应较为强烈，属正常表现。6、观察受体腹膜上血管的走向，选定向哪一侧的肾脏植入卵巢：不植入卵巢的一侧在卵巢正上方的腹膜上剪开一个0.5cm左右的切口用于卵巢摘除；植入卵巢的一侧在肾脏正上方的腹膜上以剪刀剪开一个1cm左右的切口此切口的位置和大小很重要：切口下端在肾脏下端，上端到小鼠最后一肋的内侧。如果切口大小合适，肾脏迁出后不会缩回体腔。注意

7、避开受体腹膜上的血管，切口的走向和位置都要根据受体的血管走向灵活调整，剪开任何一个0.3mm粗的动脉都可能导致受体大出血！理想的切口如下图蓝线所示：6、摘除受体两侧的卵巢：用镊子迁出卵巢，并用止血钳夹住卵巢的脂肪垫固定。以缝合线在输卵管处将入巢动脉和输卵管一起结扎，并用镊子摘除卵巢。若结扎不成功，受体将在卵巢摘除后大出血。7、在体视镜下将聚合卵巢植入受体肾包囊下：用5号钟表镊子在肾包囊上开一小口，开口不能太大，应该跟供体大小一样即可，由于肾包囊有弹性，可以比移植管口小一点。用青霉素-生理盐水湿润肾包囊这点很重要，肾包囊表面水分蒸发后会变得很硬，移植管无法伸入，供体难以移入切口深部！以移植管吸取

8、待移植的聚合卵巢并植入到受体肾囊下，注意供体应尽量远离肾囊的开口以免其滑出。植入后，可以使用圆端弯折的粉刺针辅助调整供体的位置。建议在肾脏的上端开口，能有效防止移植物在随后的操作中滑出。开口时左手使用钝化的5号钟表镊子夹持肾囊，右手使用尖锐的5号钟表镊子刺穿肾囊并开口。8、将受体肾脏放回体腔中，注意避免供体在此时被受体腹膜挤压而滑出！向体腔中注入青霉素-生理盐水，依次缝合腹膜和皮肤上的切口，在伤口上涂抹碘酒。9、将做完手术的小鼠放回笼中，注意保暖并置于日光灯下待其苏醒。气温较低时，用小太阳供暖。气温干燥时注意使用生理盐水润湿小鼠眼睛手术过程中小鼠的眼睛是一直睁开的。附件：1、 手术所需的仪器设

9、备：超净工作台；4倍放大的体视镜；无影灯。使用前开紫外照射灭菌30min。2、 手术所需的器械：一对尖端完整的5号钟表镊子（用于撕开肾包囊及操作供体）；一把尖端钝化的5号钟表镊子（用于夹持肾包囊，可由废弃的5号钟表镊子改造）；两把止血钳（分别用于夹持卵巢脂肪垫和缝合持针）；三把小手术剪（分别用于剪毛，皮肤和腹膜）；三把细尖镊子（分别用于剪皮肤和腹腔内操作）；4号或更细的缝合线一卷；弯针数枚；一把圆端弯折过的粉刺针（用于植入后调整供体在肾包囊下的位置）。所有器械使用前必需湿热灭菌并烘干。手术前开紫外灯照射30min。用毕后用酒精棉球擦干净放回器械盒中。3、 移植管的制作：移植管用于吸入供体，并将

10、供体植入受体肾包囊下。其优点：可以避免用镊子夹持转移供体，还可以直接深入切口深部，避免用镊子将供体挤压到深部，因而可以保证供体完整植入而不变形；对于比较小的供体，一次可植入数个，提高移植效率。移植管是将一根拉制成特定形状的玻璃毛细管和注射器用封口膜连接制成。使用时将移植管接在胶皮管一端，另一端接一个带棉塞的1ml枪头放在口中操作。用毕后用青霉素-生理盐水反复洗涤后再用75%酒精洗涤。4、 参考文献：安德拉斯.纳吉等著，孙青原等译小鼠胚胎操作实验手册(第三版)化学工业出版社：此书中详述了小鼠的IP注射，小鼠手术的基本操作，口吸管的制作及肾囊移植的参考步骤等宝贵信息，施术前请仔细参读。肾包囊移植教

11、学网址：/tools/mousework/Cunha001/Pages/Written_Method.html 该网址图解了手术过程，施术前请仔细参读。另附本文作者基于此技术发表的文章一篇，欢迎大家引用，谢谢：Recovery of functional oocytes from cultured premeiotic germ cells after kidney capsule transplantation. Stem Cells Dev. 2013 Feb 15;22(4):567-80. 链接：Avertin储存液浓度 1.2%工作液浓度 0.2 ml/10g或240 mg/kg储存液、工作液均4避光保存，使用前现配。储存液：三溴乙醇Sigma-Aldrich, #T4,840-2 25克 1g 0.80645161g叔戊醇国产分析纯 15.5ml 0.62ml 0