湖南农业大学生物化学-03-蛋白质化学-05蛋白质的理化性质_PDF转换成word转换器

1、 第二章蛋白质化学 第二章蛋白质化学本章内容第一节 蛋白质的建筑构件氨基酸第二节 蛋白质的共价结构第三节 蛋白质的高级结构第四节 蛋白质结构与功能的关系第五节 蛋白质的理化性质第六节 蛋白质分离与纯化技术 第五节、蛋白质的理化性质蛋白质的化学反应和氨基酸的一样，游离的a-氨基、a-羧基和R基可以发生与氨基酸中相应的基团类似的反应。一、两性解离性质及等电点二、蛋白质的胶体性质三、蛋白质的沉淀四、蛋白质的变性与复性五、蛋白质的紫外吸收特性六、蛋白质呈色反应 一、两性解离性质及等电点+ OH-NH2+ OH-NH3+NH3+PrCOO-PrPr+ H+ H+COO-COOHpH< pI净电荷为

2、正pH = pI净电荷=0pH > pI净电荷为负当蛋白质溶液在某一定 pH值时，使某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为兼性离子，净电荷为零，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的 pH值即为该蛋白质的等电点（Isoelectric point，pI）n酸性AA与碱性AA的比值n中性盐的影响：可解离基团与Cl、Mg- 2+ 等电点时特点（1）净电荷为零（2）一定离子强度的缓冲液（3）多数蛋白质在水中等电点偏酸碱性AA/酸性AA比例 等电点胃蛋白酶 0.2血红蛋白 1.7细胞色素C 2.91.06.710.78.2菊糖酶0.34（4）在等电点时蛋白质的导电性、溶解度、黏度及渗透压

3、都最小。 二、蛋白质的胶体性质根据溶质在溶剂中的颗粒大小（分散程度），可以把分散系统分为3类：分散相质点小于1nm的为真溶液，大于100nm的为悬浊液，介于l100nm的为胶体溶液。分散相质点在胶体系统中保持稳定，需具备3个条件：p分散相质点大小在l-100nm范围内，介质分子对这种质点碰撞的合力不等于零，使它能在介质中不断作布朗运动；p分散相的质点带有同种电荷，互相排斥，不易聚集成大颗粒而沉淀；p分散相的质点能与溶剂形成溶剂化层，例如与水形成水化层，质点有了水化层，相互间不易靠拢而聚集。 二、蛋白质的胶体性质由于蛋白质分子量很大，在水溶液中形成 1-100nm的颗粒，因而具有胶体溶液的特征。

4、可溶性蛋白质分子表面分布着大量极性氨基酸残基，对水有很高的亲和性，通过水合作用在蛋白质颗粒外面形成一层水化层，同时这些颗粒带有电荷，因而蛋白质溶液是相当稳定的亲水胶体。 蛋白质胶体性质的应用透析：利用蛋白质不能透过半透膜的的性质，将含有小分子杂质的蛋白质溶液放入透析袋再置于流水中，小分子杂质被透析出，大分子蛋白质留在透析袋中，以达到纯化蛋白质的目的。这种方法称为透析（dialysis）。超滤：是利用外加压或离心使水和其他分子通过半透膜，蛋白质留在膜上。超滤主要用于蛋白质分子的浓缩、脱盐等。 三、蛋白质的沉淀蛋白质分子凝聚并从溶液中析出的现象，称为蛋白质沉淀(precipitation)。变性蛋

5、白质一般易于沉淀，但也可不变性而使蛋白质沉淀，在一定条件下，变性的蛋白质也可不发生沉淀。蛋白质所形成的亲水胶体颗粒具有三种稳定因素：颗粒表面的水化层；电荷；布朗运动。除去前两个稳定因素(如调节溶液pH至等电点和加入脱水剂)，蛋白质便容易凝集析出。 常用的沉淀方法：(一)盐析(Salting Out)在蛋白质溶液中加入大量的中性盐以破坏蛋白质的胶体稳定性（中和电荷的同时破坏水化层）而使其析出，这种方法称为盐析。常用有硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等。(二)重金属盐沉淀蛋白质蛋白质可以与重金属离子如汞、铅、铜、银等结合成盐沉淀，当蛋白质分子带较多的负离子时，更易进行。(三)生物碱试剂以及某些酸类沉淀蛋白质

6、蛋白质可与生物碱试剂(如苦味酸、钨酸、鞣酸)以及某些酸(如三氯乙酸、过氯酸、硝酸)结合成不溶性的盐沉淀，当蛋白质带正电荷时，易于与酸根负离子结合成盐。这类沉淀反应经常被临床检验部门用来除去体液中干扰测定的蛋白质。 常用的沉淀方法：(四)有机溶剂沉淀蛋白质向蛋白质溶液中加入一定量的极性有机溶剂（甲醇、乙醇或丙酮等），因引起蛋白质脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用，致使蛋白质颗粒容易凝集而沉淀。有机溶剂沉淀法，如果控制在低温下操作并且尽量缩短处理的时间则可使变性速度减慢。(五)加热凝固加热蛋白质溶液，可使蛋白质发生凝固(coagulation)而沉淀。e.g.将大豆蛋白质的浓溶液

7、加热并点入少量 盐卤（含 MgCl2）制作豆腐。 四、蛋白质的变性与复性某些物理因素和化学因素，使蛋白质分子的空间构象被破坏，并导致蛋白质的理化性质和生物学功能随之改变或丧失，这种现象称为变性作用（denaturation）。其本质是破坏了形成与稳定蛋白质分子空间构象的次级键，从而导致蛋白质分子空间构象的改变或破坏，而并不涉及蛋白质一级结构的改变或肽键的断裂。n生物活性的丧失是变性的主要表现；n构象的破坏是蛋白质变性的结构基础。 四、蛋白质的变性与复性物理因素：高温、紫外线、X-射线、超声波、高压、剧烈的搅拌、震荡等（表面张力）化学因素：强酸和强碱（破坏解离状态等）、尿素和盐酸胍（竞争氢键）、

8、去污剂（破坏疏水键）、浓乙醇（破坏疏水2+ + 2+键等）、重金属盐（如Hg 、Ag 、Pb 等）等。表征：生物活性丧失；物理性质（溶解度、粘度、扩散系数、光谱特性等）和生物化学性质（易被蛋白酶分解）改变。蛋白质的变性作用如果不过于剧烈，则是一种可逆过程，变性蛋白质通常在除去变性因素后，可缓慢地重新自发折叠成原来的构象，恢复原有的理化性质和生物活性，这种现象成为复性（renaturation）。 核糖核酸酶变性与复性作用8 M脲，巯基乙醇变性透析复性天然状态还原变性状态 五、蛋白质的紫外吸收特性蛋白质在远紫外光区（ 200-230nm）有较大的吸收，在280nm 有一特征吸收峰，可利用这一特性

9、对蛋白质进行定性定量鉴定。注意事项：测定范围 0.10.5mg/mL经验公式法：蛋白质质量浓度（mg/ml）= 1.55A 2801cm- 0.76A1cm260 六、蛋白质呈色反应1、茚三酮反应NH2末端的氨基酸残基也能与茚三酮发生定量反应，生成有色物质，可用于蛋白质的定性、定量分析。2、酚试剂反应蛋白质可以与酚制剂（如Folin酚）发生反应生成蓝紫色化合物，可以用于蛋白质的精确定量分析。3、双缩脲反应是肽与蛋白质所特有、而氨基酸则没有的一个颜色反应。含有两个或两个以上肽键的化合物，与CuSO4碱性溶液都能发生双缩脲反应而生成紫红色或蓝紫色的复合物，可用于测定蛋白质的含量。 蛋白质的颜色反应

10、 第二章蛋白质化学本章内容第一节 蛋白质的建筑构件氨基酸第二节 蛋白质的共价结构第三节 蛋白质的高级结构第四节 蛋白质结构与功能的关系第五节 蛋白质的理化性质第六节 蛋白质分离与纯化技术 第六节 蛋白质分离与纯化技术一、蛋白质分离、纯化一般原则二、蛋白质分离、纯化方法三、蛋白质含量测定和纯度鉴定 一）蛋白质分离、纯化一般原则对于任何一种蛋白质都有可能选择一套适当的分离纯化程序以获得高纯度的制品。蛋白质纯化的总目标是增加制品的纯度或比活，以增加单位蛋白质重量中所需蛋白质的含量或生物活性。分离纯化某一特定蛋白质的一般程序可以分为：1、前处理2、粗分级分离3、细分级分离 1、前处理分离纯化某一蛋白质

11、，首先要将蛋白质从原来的组织或者细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，不丢失生物活性。动物材料：剔除结缔组织及脂肪组织种子材料：去壳、去种皮、脱脂破细胞动物组织或细胞：电动捣碎机、匀浆器、超声波处理植物组织和细胞：存在细胞壁（纤维素、果胶等），利用石英砂、玻璃粉以及适当的提取液研磨，或用纤维素酶处理细菌细胞： 超声震荡、研磨、溶菌酶处理如果目的蛋白质集中在某一细胞器中，如细胞核、染色体、核糖体、可溶性细胞质等，则可以采用差速离心的方法对相应的细胞组分进行富集。 不同离心场下沉降的细胞组分相对离心场（g）1000时间（min）沉降的组分真核细胞5400010叶绿体、细胞碎片、细胞核线

12、粒体、细菌15 000203030 000溶酶体、细菌细胞碎片核糖体100 0003 10（h）相对离心场（Relative Centrifugal Field, RCF），以重力加速度g（980.66 cm/s ）2的倍数表示。4 p3600 x 980其中：离心机转数为（r/min）r为平均半径，以cm为单位，指离心机旋转轴到离心管中间的距离(r/min)2·r2= 11.19 x 10 (r/min)-5 2·rRCF = 2、粗分级分离粗分级分离（Rough Fractionation）：当蛋白质提取液获得以后，选用一套适当的方法，将所要的蛋白质与其他杂蛋白分离开来

13、。常用方法：盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级分离等特点：简便、处理量大，既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质溶液。蛋白质溶液浓缩方法：超过滤、凝胶过滤、冷冻真空干燥、聚乙二醇，等 3、细分级分离细分级分离（Fine Fractionation）：样品经过粗分级分离后，一般体积较小，杂蛋白大部分已被除去，需要对样品进行进一步纯化。常用的方法：1、层析法：包括凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等；2、电泳法：包括区带电泳、等电聚焦等特点：规模较小，但分辨率很高 二、蛋白质分离、纯化方法蛋白质分离纯化的方法，是以目的蛋白质与杂蛋白或其他杂质成分在溶液中下列性质的差异为原理的：1、分子大小2、溶解

14、度3、带电荷性质4、吸附性质5、对配体分子的生物学亲和力 1、根据分子大小不同的纯化方法1）透析和超（过）滤2）密度梯度（区带）离心3）凝胶过滤 1）透析和超（过）滤透析袋透析（ dialysis）：利用蛋白质分子不能通透析液过半透膜的性质，使蛋白质和其它小分子物质如无机盐、单糖等分开。搅拌子常用的半透膜是玻璃纸（赛璐玢纸）、火棉纸（赛璐琔纸）以及其它改进型的纤维素材料。磁力搅拌器透析装置示意图超过滤（ultrafiltration）：利用压力或者离心力，强行使水和其它小分子溶质通过半透膜，而蛋白质被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐的目的。滤膜离心 2）密度梯度（区带）离心蛋白质颗粒的沉降，不仅决

15、定于滴加样品其大小，而且取决于其密度。蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比小的颗粒沉降得快，并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身的密度相等的介质密度梯度时，即停止不动，最后，各种蛋白质在离心管中被分离成各自独立的区带。4%8%离心管蔗糖浓度12%16%20%分成区带的蛋白质可以在管底刺一个小孔逐滴放出，分部收集。蔗糖密度梯度 3）凝胶过滤凝胶过滤，又称凝胶过滤层析，也称分子排阻层析或凝胶渗透层析，是根据分子大小分离蛋白质混合物的最有效方法之一。A、凝胶过滤的介质B、凝胶过滤的原理 A、凝胶过滤的介质凝胶过滤所用的介质是凝胶珠或称凝胶颗粒，其内部是多孔的网状结构。凝胶的交联度或

16、孔度（网孔大小）决定了凝胶的分级分离范围，即能够被该凝胶分离开的蛋白质混合物的相对分子量范围，例如：Sephadex G-50的分级分离范围是 1500 30000排阻极限有时候也被用来表示分级分离范围的上限，其定义为“不能扩散进入凝胶珠微孔的最小分子的相对分子量”，例如：Sephadex G-50的排阻极限为 30000目前经常使用的凝胶有交联葡聚糖（ Sephadex）、聚丙烯酰胺凝胶(Bio-gel P)和琼脂糖(Sepharose或Bio-Gel A)等。 B、凝胶过滤的原理蛋白质混合物小溶质分子大溶质分子水化的凝胶颗粒多孔板当不同大小的蛋白质流经凝胶层析柱时，比凝胶孔径大的分子，不能

17、进入珠内的网状结构，而被阻挡在凝胶珠之外，随着溶剂在凝胶珠之间的间隙向下移动，首先流出凝胶柱。比网孔小的分子，不同程度地进入凝胶珠中，以不同的速度流出层析柱。 2、利用溶解度差异的纯化方法利用蛋白质溶解度的差别来分离纯化蛋白质是实践中最常用的方法。1） 等电点沉淀和 pH控制2） 蛋白质的盐溶和盐析3） 有机溶剂分级分离4） 温度对蛋白质溶解度的影响 1）等电点沉淀和 pH控制蛋白质是带有正电荷和负电荷pH、离子强度对b-乳球蛋白溶解度的影响基团的两性电解质，带电基团的电3荷数量可根据 pH的不同而变化。20 mmol/L当蛋白质处于等电点状态时，其净电荷数为零，相邻分子间不存在静电排斥力，分

18、子间容易相互聚集沉淀。因此，在其它条件相同时，处于等电点状态的蛋白质溶解度最低。210 mmol/L15 mmol/L不同的蛋白质具有不同的等电点，因此，可以通过等电点沉淀的方法将它们分离。1 mmol/L04.85.05.25.45.6pH 2 ）蛋白质的盐溶和盐析中性盐对球状蛋白质的溶解度有显著的影响。0.60.4盐溶(salting in)：蛋白质分子吸附盐离子后，带电层使得蛋白质分子之间相互排斥，而蛋白质分子与水之间的相互吸引增加，溶解度提高。0.20.0盐析(salting out)：溶液的离子强度增加到一定的程度时，可以使蛋白质从水溶液中沉淀出来。-0.21.02.0离子强度（I）

19、原因：溶液中的水大部分成为盐离子的水化水，不再参与蛋白质表面疏水基团溶剂化，导致蛋白质疏水表面暴露，并由于疏水相互作用而沉淀。等电点状态下，K2SO4对血红蛋白溶解度的影响 3 ）有机溶剂分级分离与水互溶的有机溶剂（如乙醇、丙酮等），能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。室温下，这些溶剂不但可以引起蛋白质的沉淀，同时还伴随着蛋白质的变性。如果预先将有机溶剂冷却到 -40至-60，同时不断搅拌以避免局部有机溶剂浓度过高的现象发生，则可以在很大的程度上避免蛋白质的变性。实例：用25%的-5乙醇可以将卵清蛋白与卵清中的其他蛋白分开。基本原理有机溶剂可以降低水溶液的介电常数，从而增加相反电荷之间的吸引力。

20、蛋白质分子表面的可解离基团离子化程度减弱，水化程度降低，从而促进了蛋白质分子的聚集而导致沉淀。与盐析相似，有机溶剂与蛋白质直接争夺水化层，致使蛋白质聚集沉淀。 4 ）温度对蛋白质溶解度的影响在一定的温度范围内，大部分球状蛋白质的溶解度随着温度的升高而增加。例外人类血红蛋白的溶解度，在 0 25之间，随温度上升而下降。0 40温度高于40 50，大部分蛋白质变得不稳定，容易发生变性。低于 0时，运用：在低温下分离纯化蛋白质。 3、根据电荷不同的纯化方法根据蛋白质电荷性质的不同、亦即蛋白质酸碱性质的不同分离蛋白质混合物的方法可以分为两类：1）电泳2）离子交换层析 电泳的原理在一定pH条件下，某些物

21、质分子会成为带电的粒子，不同的物质，由于其带电性质、颗粒形状和大小不同，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，因此可将它们分离。带电粒子在电场中的移动与:粒子大小有关，颗粒直径愈小愈快粒子的电荷有关，电荷愈多愈快粒子的形状有关，愈接近球形愈快 电泳的分类原则上按电泳的原理来分，可分为二类：Ø自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂贵，费时费力，不便于推广应用。Ø区带电泳：是指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用主要是防止电泳过程中的对流和扩散，以使被分离的成分得到最大分辨率的分离。

22、区带电泳由于采用的介质不同以及技术上的差异，又可分为不同的类型。 区带电泳p滤纸电泳和薄膜电泳（如醋酸纤维素薄膜电泳，聚酰胺薄膜电泳）p粉末电泳：支持介质是淀粉、纤维素粉或硅胶粉p细丝电泳：如尼龙丝和其他人造丝电泳。p凝胶电泳：聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、淀粉凝胶电泳。 滤纸电泳：指用滤纸作为支持介质的电泳方法。是最早使用的区带电泳。醋酸纤维素薄膜电泳：分离速度快、电泳时间短、样品用量少，比纸电泳分辨率高。适合于病理情况下微量异常蛋白的检测。以上二种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。 凝胶电泳+-ABC图中A，B，C均为阳离子，分子量大小依次为M

23、A=MB>MC，所带电荷量相同QA=QB=QC。电荷效应和分子筛效应共同作用分子筛效应：分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。分子量小，阻力小，移动快；分子量大，阻力大，移动慢。 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖(agarose)是从琼脂中精制出来的胶状多糖，琼脂又是从天然的红色的墨角藻(red-seaweed)中提取出来的。ü琼脂糖凝胶属于大孔胶，可以分析10 的大分子，7但电泳分辨率低于聚丙烯酰胺凝胶电泳。ü具有稳定的物理化学性质，对样品吸附极小；ü琼脂糖无毒，具有热可逆性，胶凝过程不需催化剂

24、，制备简单、快速。ü琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，染色、脱色程序简单快速； 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N,N-methylenebisacrylamide，简称Bis)在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。用此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophorsis，简称PAGE)。ü凝胶透明，有弹性，机械性能好ü凝胶性能稳定，电渗作用小，无吸附，化学惰性强。电泳过程中不受温度、pH的变化的影响。&#

25、252;集浓缩、分子筛和电荷效应为一体，具有高分辨率，重复性好 电泳 2）离子交换层析离子交换层析是利用离子交苯乙烯(单体)+苯二乙烯(交联剂)换剂上的可交换离子与周围介质中被分离的各种离子间的亲和力不同，经过交换平衡达到分离的目的的一种柱层析法。共聚功能基反应基质H2SO4基质(骨架)R SO3 H离子交换树脂固定离子可交换离子活性基团基质固定离子可交换离子 按载体种类不同Ø离子交换树脂：主要有聚苯乙烯树脂阳离子交换树脂强酸型含磺酸基团(R-SO3H)中等酸型含磷酸基团(-O-PO2H4)弱酸型含酚基、羧基阴离子交换树脂强碱含季胺基团-N+ (CH)弱碱含叔胺、伯胺基团-N(CH)

26、3332Ø离子交换纤维素：阴离子交换纤维素（DEAE-纤维素，阳离子交换纤维素（CM-纤维素）Ø离子交换凝胶：葡聚糖（Sephadex）、聚丙烯酰胺（PAG）、琼脂糖（Sepharose） 离子交换反应离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要是以离子交换方式进行。所进行的离子交换反应是可逆的。假定以+RX代表阳离子交换剂，在溶液中解离出来的阳离子X 与溶液中的阳离子Y 可发生可逆的交换反应，反应式为：+离子交换现象方程式：R-X+ Y+R Y + X- + +R-+: 阳离子交换剂的功能基团和载体: 平衡离子XY: 交换离子 离子交换层析的基本步骤平衡装柱离子交换剂带

27、上反离子(R-O-X )+上样样品（AB+ ，C ，等）与反离子（X ）竞争与电荷基, + 团结合；（结合力A > B+>Y >C >X ） + + 洗脱洗脱液中的离子成分（Y ）与样品(A 等）竞争结合电 荷基团，首先C洗下来，随着Y浓度增加，B洗脱出，最后A出来，使样品分离。所以从上样到洗脱都是根据结合力的大小进行进行的。洗脱液的选择很重要，要使有效成分和杂质分离。 4、利用选择性吸附的纯化方法某些固体物质具有将其他种类分子吸附在自己表面的能力，被称为“吸附剂”。吸附过程涉及范德华力、氢键等非离子吸引力。吸附层析就是利用待纯化的分子与杂质分子与吸附剂之间的吸附能力以

28、及解吸附能力的性质不同而达到分离的目的。典型的吸附剂有硅胶、氧化铝、活性炭等。运用实例1、羟磷灰石层析：用于选择性除去DNA2、疏水作用层析：高效蛋白质分离纯化方法利用不同蛋白质表面所存在的疏水性氨基酸残基的数量的不同。 5、利用对配体的特异生物学亲和力亲和层析：利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力建立起来的一种有效的纯化方法，目前已广泛应用于核苷酸、核酸、免疫球蛋白、膜受体、细胞起乃至完整细胞的纯化。蛋白质混合物琼脂糖凝胶珠连接臂目的蛋白质得到纯化配体分子 5、利用对配体的特异生物学亲和力 三、蛋白纯化原则Guidelines for Protein PurificationØ

29、确定目标 purity, activity and quantityØ充分了解目的蛋白及主要杂质的理化特性 to simplify technique selection and optimisationØ确定活性测定方法（enzymatic assays，ligand-bindingassays，immunological assays） fast detection of protein activity/recovery and criticalcontaminantsØ尽量减少纯化步骤 extra steps reduce yield and increase time, combine stepslo