TAILPCR原理及应用学习教案

1、会计学1TAILPCR原理原理(yunl)及应用及应用第一页，共16页。 在分子生物学研究中,基因克隆和分子杂交的探针制备等操作常需分离与已知DNA 序列邻近的未知序列。 热不对称交错PCR (thermal asymmetric interlaced PCR, TAIL-PCR)是一种用来分离与已知序列邻近的未DNA 序列的分子生物学技术。 在分子生物学研究领域中,利用该技术分离出的DNA 序列可以用于图位克隆、遗传图谱绘制的探针,也可以直接测序。 该技术技术简单易行,反应高效灵敏,产物(chnw)的特异性高,重复性好,能够在较短的时间内获得目标片段,已经成为分子生物学研究中的一种实用技术。

2、介绍介绍(jisho)第1页/共16页第二页，共16页。结构结构(jigu)1，TAIL PCR原理原理2，TAIL PCR引物设计引物设计(shj)3，TAIL PCR反应条件反应条件4，TAIL PCR优缺点及其优化优缺点及其优化5，TAIL PCR应用应用第2页/共16页第三页，共16页。 TAIL PCR以基因组DNA 作为模板，利用依照目标序列旁的已知序列设计(shj)的3 个较高退火温度的嵌套特异性引物(special primer, SP)，和一个较短且Tm 值较低的随机简并(arbitrary degenerate, AD)引物组合，通过3 轮具热不对称的温度循环的分级反应来进

3、行PCR 扩增，获得已知序列的侧翼序列。原理原理(yunl)目的(md)片段第3页/共16页第四页，共16页。第1 次PCR 反应 由5 次高特异性反应、1 次低特异性反应、15 次热不对称的大循环构成。通过5 次高特异性的反应,使sp1 与已知的序列退火并延伸,提高(t go)目标序列的浓度。1 次低特异性的反应使简并引物结合到较多的目标序列上, 随后进行15 次TAIL 循环。经过上述反应得到了不同浓度的3 种类型的产物:特异性产物和非特异性产物( 型和型)TAIL-PCR 一般一般(ybn)分为分为3 次反应次反应第4页/共16页第五页，共16页。第2 次反应 将第一级反应的产物稀释(x

4、sh)1000 倍作为模板,通过15 次热不对称的大循环,使特异性的产物被选择性地扩增,而非特异性的产物被压制到极低的含量。第5页/共16页第六页，共16页。第3 次反应 又将第2 次反应的产物稀释1000 倍作为模板,通过(tnggu)15 次热不对称的大循环。第6页/共16页第七页，共16页。通过通过(tnggu)上述上述3 次次PCR 反应可获得较高含量的与已知序列邻近的目标序列。反应可获得较高含量的与已知序列邻近的目标序列。、分别为TAIL2PCR 反应(fnyng)中第2 次和第3 次反应(fnyng)的产物TAIL2PCR 产物(chnw)分析 在多数情况下,第1 次反应有较多的非

5、特异性产物特异性引物在第1 次反应中一般不能扩增到可被检测的水平,因此可以省去第1 次反应产物电泳分析，仅仅检测第2 次和第3 次反应的产物来获得特异性的目标片段。取第2 次反应产物和第3 次反应产物成对点样。由于特异引物是嵌套的,因此特异性扩增的特点是第3 次反应产物小于第2 次反应产物。 由于AD 引物在特异性引物的下游有多个退火位点,同一目标序列有时会产生一个以上不同长度的特异性片段。第7页/共16页第八页，共16页。TAIL-PCR 引物设计引物设计(shj) 和一般的PCR 反应相比，TAIL-PCR 反应对引物的要求较高，引物的设计很是重要。特异性引物和简并引物的选择(xunz)直

6、接影响扩增的效果。特异引物设计特异引物设计 3 个嵌套的特异性引物长度一般在2030 bp 之间，Tm 值一般设为5868。SP1、SP2 和SP3 之间最好相距100 bp 以上以便在电泳时更容易区分3 轮PCR 产物。简并引物设计简并引物设计 简并引物是按照物种普遍存在的蛋白质的保守氨基酸序列设计的，相对较短，长度一般是14 bp左右，Tm 值介于3048之间。AD 引物是否最佳与它的简并度、引物长度和核苷酸序列组成有很大关系。为了更好的与目标序列退火：首先，尽量选择简并度低的氨基酸区域作为引物设计区；其次，充分注意物种对于密码子的偏好性，选择该物种使用频率高的密码子，以降低引物的简并性；

7、最后，尽量避免3 末端的简并。第8页/共16页第九页，共16页。反应文件号循环次数温度设定第1 次反应1 1 94 2 min ,95 1 min 2 5 94 15 s ,63 1 min ,72 2 min 3 1 94 15 s ,30 3 min , 以0. 2 / s 升至72 72 2 min 4 15 94 5 s ,63 1 min ,72 2 min 94 5 s ,63 1 min ,72 2 min 94 5 s ,44 1 min ,72 2 min 5 1 72 2 min 第2 次反应4 15 94 5 s ,63 1 min ,72 2 min 94 5 s ,6

8、3 1 min ,72 2 min 94 5 s ,44 1 min ,72 2 min 51 72 2 min 第3 次反应4 15 94 5 s ,63 1 min ,72 2 min 94 5 s ,63 1 min ,72 2 min 94 5 s ,44 1 min ,72 2 min 51 72 5 min TAIL-PCR 反应反应(fnyng)条件条件5 次高特异性反应(fnyng)1 次低特异性反应(fnyng)15 次热不对称的大循环15 次热不对称的大循环15 次热不对称的大循环Table 1 Cycle settings used for TAIL-PCR第9页/共16

9、页第十页，共16页。TAIL-PCR 反应(fnyng)条件Table 2 TAIL-PCR 反应混合液的组成 （30 L）ReagentAmount in primary Reaction/L Amount in secondary reaction/L Amount in tertiary reaction/L 10PCR buffer 2 2 2 2 mmol/L dNTPS 2 2 2 10 mol/L gene specific Primer 1 1 1 10 mol/L AP Primer 4 4 4 Template 1 1 1 Taq DNA polymerase (5u/L)

10、0.2 0.2 0.2 ddH2O to 20 L20 L20 L 每次使用(shyng)不同SP引物第2、3次为前一次稀释(xsh)1000倍第10页/共16页第十一页，共16页。 TAIL-PCR 技术(jsh)优缺点TAIL-PCR 方法直接通过3 轮PCR 反应来得到目的片段，省去了诸如：酶切、连接、加尾等传统的基因克隆方法中的繁琐步骤(bzhu)；而且TAIL-PCR 方法又克服了常规PCR 不能对已知DNA 序列侧翼的未知序列进行扩增的缺点，能快速地分离到目标序列。优点：优点：(1) 操作简便，省时，只要设计好引物操作简便，省时，只要设计好引物,即可以用基因组即可以用基因组DNA

11、作模板直接筛选到目标序列。作模板直接筛选到目标序列。(2) 成本低成本低 ，TAIL-PCR 只需要设计几个嵌套特异引物和只需要设计几个嵌套特异引物和简并引物即可，大大降低了成本简并引物即可，大大降低了成本(3) 高特异性，用短的简并引物和长的特异性嵌套引物相高特异性，用短的简并引物和长的特异性嵌套引物相组合组合,通过不对称的温度循环和分级反应通过不对称的温度循环和分级反应,使反应体系有利使反应体系有利特异引物的扩增。特异引物的扩增。(4) 高灵敏性，使用任何高灵敏性，使用任何(rnh)一个一个AD 引物引物,在在60 %80 %的反应中能够产生特异性产物。运用不同的的反应中能够产生特异性产物

12、。运用不同的AD 引物引物就能够有效地扩增到目标片段。就能够有效地扩增到目标片段。(5) 快速。整个快速。整个TAIL2PCR 反应循环能够在反应循环能够在1 d 内完成内完成,可可以快速地获得目标片段以快速地获得目标片段 。第11页/共16页第十二页，共16页。缺陷：缺陷： (1) 反应条件设置要求精细，因为反应条件设置要求精细，因为(yn wi)TAIL-PCR 是是3 轮连续的嵌套的反应。若是其中一轮出现失误，将会直轮连续的嵌套的反应。若是其中一轮出现失误，将会直接影响下一循环的工作。接影响下一循环的工作。(2) TAIL-PCR 反应需要较多的引物组合，因为反应需要较多的引物组合，因为

13、(yn wi)不同的不同的AD 引物具有不同的结合位点。引物具有不同的结合位点。(3) TAIL-PCR 反应不是每次都有阳性结果。因为反应不是每次都有阳性结果。因为(yn wi)AD 引物存在有限的结合位点，在个别侧翼序列的扩引物存在有限的结合位点，在个别侧翼序列的扩增中，即使使用不同的简并引物也难以获得阳性结增中，即使使用不同的简并引物也难以获得阳性结第12页/共16页第十三页，共16页。优化优化优化优化TAIL-PCR反应的一些反应的一些(yxi)环节，可大大增加反应产环节，可大大增加反应产物的特异性物的特异性优化优化 1，3 次循环中增设不同的退火温度，设计特异引物时选择合适的次循环中

14、增设不同的退火温度，设计特异引物时选择合适的Tm，这样会更有利于特异目的片段的富集，这样会更有利于特异目的片段的富集优化优化 2，延长，延长3 次次PCR 循环中的变性时间和延伸时间，变性时间延长到了，有利于循环中的变性时间和延伸时间，变性时间延长到了，有利于DNA 彻底解链；延伸时间延长，更有利于较长的侧翼序列的获得。彻底解链；延伸时间延长，更有利于较长的侧翼序列的获得。优化优化 3，热不对称，热不对称PCR 循环次数适当增加，或不对对称设置为循环次数适当增加，或不对对称设置为3:1。优化优化 4，简并引物可以做一个，简并引物可以做一个(y )混合物，将几个引物组合在一起，在反应时混合物中各个引物依然维持原来的浓度，提高目标条带扩增的机率。混合物，将几个引物组合在一起，在反应时混合物中各个引物依然维持原来的浓度，提高目标条带扩增的机率。第13页/共16页第十四页，共16页。TIAL-PCR 的应用的应用(yngyng) 1. 根据已知的基因或分子标记连续步移，获取人、动物和植物的重要调控基因，可以用于研究结