生物样品中生物大分子的分离纯化

1、生物样品中生物大分子的生物样品中生物大分子的分离纯化分离纯化1 生物大分子指的是作为生物体内主要生物大分子指的是作为生物体内主要活性成分活性成分的各种的各种分子量达到上万或更多分子量达到上万或更多的的有机分子，有机分子，结构结构具有一定的规律性，大多是由基本结构单位按一具有一定的规律性，大多是由基本结构单位按一定顺序和方式连接而形成的多聚体。常见的生物定顺序和方式连接而形成的多聚体。常见的生物大分子包括大分子包括蛋白质蛋白质( (包括酶包括酶) )、核酸核酸、多聚糖多聚糖等。等。实际上生物大分子的实际上生物大分子的特点特点在于其表现出的在于其表现出的各种生各种生物活性物活性和在生物和在生物新陈

2、代谢新陈代谢中的作用。中的作用。什么是生物大分子？什么是生物大分子？2生物大分子的理化性质生物大分子的理化性质l 在水和各种有机溶剂中的在水和各种有机溶剂中的溶解性溶解性。l 在在不同温度、不同温度、pH pH 值和各种缓冲液值和各种缓冲液中生物大分子的稳定性。中生物大分子的稳定性。l 固态时和冻干时的稳定性。固态时和冻干时的稳定性。l 物理性质：物理性质： 分子的大小分子的大小、穿膜的能力、穿膜的能力、带电的情况带电的情况、在电、在电场中的行为、场中的行为、 离心沉降的表现离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数等。中的分配系数等。l 化学性质：化学性质：

3、对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的试剂的稳定性稳定性。l 对其他生物分子的对其他生物分子的特殊亲和力特殊亲和力等。等。3生物大分子分离纯化的特殊性生物大分子分离纯化的特殊性l 生物材料的组成生物材料的组成复杂复杂，种类极多种类极多。l 许多生物大分子在生物材料中的许多生物大分子在生物材料中的含量极微含量极微，分离纯化的，分离纯化的步步骤多骤多，流程长流程长。l 许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活极易失活，因此分离过程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制因此分离过程中如何防止其失活，就

4、是生物大分子提取制备最困难之处。备最困难之处。l 生物大分子的制备几乎都是在生物大分子的制备几乎都是在溶液中溶液中进行的，温度、进行的，温度、pHpH值、值、离子强度等离子强度等各种参数各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断。准确估计和判断。4生物大分子分离与纯化基本步骤生物大分子分离与纯化基本步骤一、一、前期准备前期准备二、组织与细胞破碎二、组织与细胞破碎三、初步分离提取三、初步分离提取四、精细分离纯化四、精细分离纯化五、生物大分子含量的测定和纯化鉴定五、生物大分子含量的测定和纯化鉴定六、产品处理：浓缩、干燥和保存六、产品处理：浓缩、干燥和保存

5、5一、前期准备一、前期准备（一）一） 明确目的和要求明确目的和要求（二）（二） 了解的生物大分子的物理化学性质了解的生物大分子的物理化学性质溶解性、稳定性、亲和力、缓冲液、溶解性、稳定性、亲和力、缓冲液、pH（三）（三） 生物材料的选择和预处理生物材料的选择和预处理6（三）、生物材料的选择和预处理（三）、生物材料的选择和预处理l从工业角度考虑从工业角度考虑l从科研角度考虑从科研角度考虑l选材时，注意材料的季节性，动物的生理状态，微生物的生长期，选择的选材时，注意材料的季节性，动物的生理状态，微生物的生长期，选择的材料应含量高、来源丰富、成本低，尽可能保持新鲜，尽快加工处理。材料应含量高、来源丰

6、富、成本低，尽可能保持新鲜，尽快加工处理。l材料选定以后要预处理材料选定以后要预处理动物组织要先除去结缔组织、脂肪等非活性部分，绞碎后在适当的溶剂动物组织要先除去结缔组织、脂肪等非活性部分，绞碎后在适当的溶剂中提取，如果所要求的成分在细胞内，则要先破碎细胞。中提取，如果所要求的成分在细胞内，则要先破碎细胞。植物要先去壳、除脂。植物要先去壳、除脂。微生物材料要及时将菌体与发酵液分开。微生物材料要及时将菌体与发酵液分开。生物材料如暂不提取，应冰冻保存。动物材料则需深度冷冻保存。生物材料如暂不提取，应冰冻保存。动物材料则需深度冷冻保存。7生物大分子分离与纯化基本步骤生物大分子分离与纯化基本步骤一、前

7、期准备一、前期准备二、二、组织与细胞破碎组织与细胞破碎三、初步分离提取三、初步分离提取四、精细分离纯化四、精细分离纯化五、生物大分子含量的测定和纯化鉴定五、生物大分子含量的测定和纯化鉴定六、产品处理：浓缩、干燥和保存六、产品处理：浓缩、干燥和保存8二、组织与细胞破碎二、组织与细胞破碎1、机械破碎法、机械破碎法 高速组织捣碎机高速组织捣碎机：利用高速旋转的叶片：利用高速旋转的叶片产生的剪切力将组织细胞破碎。产生的剪切力将组织细胞破碎。处理材料量较大时，使用之。处理材料量较大时，使用之。 匀浆器匀浆器：匀浆器用来破碎那些比较柔软，：匀浆器用来破碎那些比较柔软，易于分散的组织细胞。科研上若材料处易于

8、分散的组织细胞。科研上若材料处理量少，可使用匀浆器。理量少，可使用匀浆器。 研磨器研磨器 92、物理破碎法：、物理破碎法： 反复冻融法反复冻融法：将待破碎的细胞冷至：将待破碎的细胞冷至15到到20，然，然后放于室温后放于室温(或或40)迅速融化，如此反复冻融多次，由于迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶而引起细胞溶胀破碎。胀破碎。 超声波处理法超声波处理法：此法是借助超声波的振动力破碎细胞壁：此法是借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。破碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长一些。和细胞器。破碎微生物细菌和酵母菌时，时间

9、要长一些。 压榨法压榨法：这是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。在：这是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。在1000105Pa2000105Pa 的高压下使细胞悬液通过一的高压下使细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。 冷热交替法冷热交替法：从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用：从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法。在此法。在90左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。二、组织与细胞破碎二、组织与细胞破碎10二、组织与细胞破碎二

10、、组织与细胞破碎3、酶学破碎方法、酶学破碎方法 酶解法酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶等，于纤维素酶等，于3737，pH8pH8，处理，处理1515分分钟，可以专一性地将细胞壁分解。钟，可以专一性地将细胞壁分解。 自溶法自溶法：将新鲜的生物材料存放于一定：将新鲜的生物材料存放于一定的的pHpH和适当的温度下，细胞结构在自身和适当的温度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下发生溶解，使细胞使细胞等）的作用下发生溶解，使细胞使细胞壁自行破裂，内含物被释放出来。壁自行破裂，内含物被释放出来。 11二、组

11、织与细胞破碎二、组织与细胞破碎4、化学破碎方法：、化学破碎方法：通过化学试剂的作用使细胞膜的透过性改变。通过化学试剂的作用使细胞膜的透过性改变。有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或SDSSDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。5、其它方法、其它方法溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗

12、透压差，溶剂分子大量进入细胞，稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，将细胞膜胀破释放出细胞内含物。将细胞膜胀破释放出细胞内含物。12生物大分子分离与纯化基本步骤生物大分子分离与纯化基本步骤一、前期准备一、前期准备二、组织与细胞破碎二、组织与细胞破碎三、三、初步分离提取初步分离提取四、精细分离纯化四、精细分离纯化五、生物大分子含量的测定和纯化鉴定五、生物大分子含量的测定和纯化鉴定六、产品处理：浓缩、干燥和保存六、产品处理：浓缩、干燥和保存13三、初步分离提取三、初步分离提取影响生物大分子提取的因素主要有：影响生物大分子提取的因素主要有： 目的产物在提取的溶剂中目的产物在提取的溶剂中

13、溶解度溶解度的大小；的大小； 由固相扩散到液相的难易；由固相扩散到液相的难易； 溶剂的溶剂的pHpH值值和和提取时间提取时间等。等。 通常极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非通常极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂；极性溶剂； 碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂；碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂； 温度升高，溶解度加大；温度升高，溶解度加大； 远离等电点的远离等电点的pHpH值，溶解度增加。值，溶解度增加。 提取时所选择的条件应有利于目的产物溶解度的增加提取时所选择的条件应有利于目的产物溶解度的增加和保持其和保持其生物活性生物活性。14三、初步分离

14、提取三、初步分离提取生物大分子一般提取方法：生物大分子一般提取方法： 水溶液提取水溶液提取：蛋白质和酶蛋白质和酶的提取一般以水溶液为的提取一般以水溶液为主。稀盐溶液和缓冲液对蛋白质的主。稀盐溶液和缓冲液对蛋白质的稳定性稳定性好，好，溶解溶解度度大，是提取蛋白质和酶最常用的溶剂。大，是提取蛋白质和酶最常用的溶剂。 有机溶剂提取有机溶剂提取：一些和：一些和脂类脂类结合比较牢固或分子结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶难溶于水、稀盐、中非极性侧链较多的蛋白质和酶难溶于水、稀盐、稀酸、或稀碱中，常用不同比例的有机溶剂提取。稀酸、或稀碱中，常用不同比例的有机溶剂提取。15三、初步分离提取三、初

15、步分离提取初步分离方法：初步分离方法： 蛋白质和酶粗制蛋白质和酶粗制：盐析法，：盐析法，等电点沉淀等电点沉淀法法，有机溶剂分级分离法等。，有机溶剂分级分离法等。 RNA 和和DNA的粗制的粗制：浓盐法、稀碱法、：浓盐法、稀碱法、苯酚法等。苯酚法等。 特点：简便，处理量大，既能除去杂质特点：简便，处理量大，既能除去杂质又能浓缩样品。又能浓缩样品。 缺点：分辨率低。缺点：分辨率低。 16生物大分子分离与纯化基本步骤生物大分子分离与纯化基本步骤一、前期准备一、前期准备二、组织与细胞破碎二、组织与细胞破碎三、初步分离提取三、初步分离提取四、四、精细分离纯化精细分离纯化五、生物大分子含量的测定和纯化鉴定

16、五、生物大分子含量的测定和纯化鉴定六、产品处理：浓缩、干燥和保存六、产品处理：浓缩、干燥和保存17四、精细分离纯化四、精细分离纯化 刚提取得到的大分子物质，往往是粗制品，含有许多杂质，刚提取得到的大分子物质，往往是粗制品，含有许多杂质，必须根据各种物质的分子大小、溶解度、带电性、亲和力大必须根据各种物质的分子大小、溶解度、带电性、亲和力大小等差异对粗制品进行进一步分离纯化。小等差异对粗制品进行进一步分离纯化。性质性质具体方法具体方法分子大小和形态分子大小和形态差速离心、超滤法、分子筛、差速离心、超滤法、分子筛、透析透析溶解度溶解度盐析、有机溶剂沉淀、等电点盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀等沉淀等

17、电荷差异电荷差异电泳、等电点聚焦、离子交换电泳、等电点聚焦、离子交换层析、吸附层析、凝胶过滤法层析、吸附层析、凝胶过滤法生物功能专一性生物功能专一性亲核层析亲核层析18生物大分子分离与纯化基本步骤生物大分子分离与纯化基本步骤一、前期准备一、前期准备二、组织与细胞破碎二、组织与细胞破碎三、初步分离提取三、初步分离提取四、精细分离纯化四、精细分离纯化五、五、生物大分子含量的测定和纯化鉴定生物大分子含量的测定和纯化鉴定六、产品处理：浓缩、干燥和保存六、产品处理：浓缩、干燥和保存19 测定多糖总量测定多糖总量菲林试剂法，蒽酮法，旋菲林试剂法，蒽酮法，旋光法等。光法等。 测定蛋白质和酶总量测定蛋白质和酶

18、总量凯氏定氮法，凯氏定氮法，Folin-酚法，双缩脲法，紫外吸收法等。酚法，双缩脲法，紫外吸收法等。 测定核酸总量测定核酸总量定磷法、紫外吸收法。定磷法、紫外吸收法。 二苯胺法测二苯胺法测DNA，地衣酚法测，地衣酚法测RNA。（一）含量的测定（一）含量的测定五、五、生物大分子含量的测定和纯化鉴定生物大分子含量的测定和纯化鉴定20五、五、生物大分子含量的测定和纯化鉴定生物大分子含量的测定和纯化鉴定（二）纯度鉴定（二）纯度鉴定 蛋白质和酶制品纯度鉴定必须采用蛋白质和酶制品纯度鉴定必须采用23种不同的鉴定种不同的鉴定方法才能确定。方法才能确定。 核酸的纯度鉴定从测核酸的纯度鉴定从测A260/A280

19、光吸收比值可判定样品光吸收比值可判定样品的纯度。的纯度。 RNA，A260/A2802以上，以上， DNA，A260/A2801.81.8左右左右, ,若若DNADNA的的A260/A2801.81.8，说，说明制剂中存在明制剂中存在RNA,RNA,需要考虑用需要考虑用RNARNA酶处理样品，提高酶处理样品，提高DNADNA纯度。纯度。 21生物大分子分离与纯化基本步骤生物大分子分离与纯化基本步骤一、前期准备一、前期准备二、组织与细胞破碎二、组织与细胞破碎三、初步分离提取三、初步分离提取四、精细分离纯化四、精细分离纯化五、生物大分子含量的测定和纯化鉴定五、生物大分子含量的测定和纯化鉴定六、六、产品处理：浓缩、干燥和保存产品处理：浓缩、干燥和保存22六、产品处理六、产品处理 浓缩、干燥浓缩、干燥浓缩：从低浓度的溶液中除去水或溶剂使之变为高浓度的溶浓缩：从低浓度的溶液中除去水或溶剂使之变为高浓度的溶液的过程。液的过程。浓缩的方法：浓缩的方法：沉淀法沉淀法蒸馏法蒸馏法吸收浓缩吸收浓缩 超滤法超滤