研基因操作PPT学习教案

1、会计学1研基因操作研基因操作2第1页/共56页31.1.保证结构的相应完整性保证结构的相应完整性2.2.排除其它大分子的污染排除其它大分子的污染( (蛋白质、多糖及蛋白质、多糖及RNARNA等等) )3.3.提取样品中不含对酶有抑制作用的有机溶剂及高提取样品中不含对酶有抑制作用的有机溶剂及高 浓度的金属离子。浓度的金属离子。核酸提取核酸提取第2页/共56页 一、一、DNADNA提取原理：提取原理：1 1、裂解细胞裂解细胞; ;3 3、苯酚和氯仿等有机溶剂能使蛋苯酚和氯仿等有机溶剂能使蛋白质变性白质变性,DNA,DNA留在上清液中；留在上清液中；4 4、上清液中加入无水乙醇使上清液中加入无水乙醇

2、使DNADNA沉淀沉淀, ,沉淀沉淀DNADNA溶于溶于TETE溶液中。溶液中。 第3页/共56页5离子型表面活性剂离子型表面活性剂: :能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使白解聚，从而使DNADNA得以游离出来。得以游离出来。 CTAB: CTAB: 十六烷基三甲基溴化铵十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide)(hexadyltrimethyl ammomum bromide)SDS: SDS: 十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate)(sodium dodecyl su

3、lfate)第4页/共56页第5页/共56页外周血外周血DNADNA的提取：的提取： 2%2%乙二胺四乙酸二钠乙二胺四乙酸二钠(EDTA)(EDTA)抗凝抗凝采血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过采血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过2h2h，44放置不超过放置不超过5h5h，以防白细胞自溶，以防白细胞自溶 1.1.适量适量抗凝血，加入磷酸缓冲盐溶液（抗凝血，加入磷酸缓冲盐溶液（PBSPBS），），混匀，混匀，3500g3500g离心离心15min,15min,倾去含裂解红细胞上清。倾去含裂解红细胞上清。2.2.用用DNADNA提取液混悬白细胞沉淀，提取液混悬白细胞沉淀，3737水

4、浴温育水浴温育1h1h加入蛋白酶加入蛋白酶K,50K,50水浴保温水浴保温3h3h，消化蛋白，消化蛋白第6页/共56页纯化纯化DNADNA：离心管中加入等体积酚离心管中加入等体积酚/ /氯仿氯仿/ /异戊醇混合液混匀，异戊醇混合液混匀，3000 rpm3000 rpm ，离心，离心10 min10 min，移上层液体至新离心管中，移上层液体至新离心管中，重复上步至除尽蛋白重复上步至除尽蛋白第7页/共56页9第8页/共56页10第9页/共56页如要分析肝脏中表达的基因，以肝脏为材料，如要分析肝脏中表达的基因，以肝脏为材料，要分析脑组织中表达的基因，以脑组织为材料要分析脑组织中表达的基因，以脑组织

5、为材料基因在多种组织中表达的，基因在多种组织中表达的，应选择较容易获得且对个体损伤最小的材料。应选择较容易获得且对个体损伤最小的材料。第10页/共56页RNARNA提取原理：提取原理：常用的是异硫氰酸胍常用的是异硫氰酸胍/ /酚法酚法强变性剂强变性剂, ,裂解细胞，同时使核蛋白复合体中裂解细胞，同时使核蛋白复合体中的蛋白变性，释放出核酸。的蛋白变性，释放出核酸。酸性条件下酸性条件下DNADNA极少发生解离，同蛋白质极少发生解离，同蛋白质一起变性被离心下来，一起变性被离心下来，RNARNA则溶于上清中则溶于上清中第11页/共56页13所用的试剂和器皿都要经过去所用的试剂和器皿都要经过去RNARN

6、A酶处理。酶处理。要严格防止要严格防止RNARNA酶的污染，酶的污染，第12页/共56页第13页/共56页第14页/共56页16酚与异硫氰酸胍组成的均相溶液酚与异硫氰酸胍组成的均相溶液 TRIZOL:TRIZOL: 该试剂可保持该试剂可保持 RNA RNA 的完整，的完整，同时进一步破碎细胞并溶解细胞成分。同时进一步破碎细胞并溶解细胞成分。第15页/共56页第16页/共56页第17页/共56页质粒质粒 DNA DNA 仍保持环状，处于可溶解状态仍保持环状，处于可溶解状态, ,高速离心，上清液即为质粒高速离心，上清液即为质粒 DNA DNA 粗制品。粗制品。第18页/共56页溶液溶液 I:I:的

7、比例是的比例是2:4:32:4:3加入加入液后，混匀过程要轻柔，避免基因组液后，混匀过程要轻柔，避免基因组DNADNA裂成短碎片而与质粒裂成短碎片而与质粒DNADNA混在一起。混在一起。第19页/共56页21四、核酸检测四、核酸检测1.1.紫外分光光度计紫外分光光度计 DNADNA纯度的判定：纯度的判定：A260/A280 A260/A280 比值应介于比值应介于1.7-2.01.7-2.0之间之间 2.2.电泳电泳第20页/共56页第21页/共56页23第22页/共56页24第23页/共56页 DNAMarker第24页/共56页26RNA第25页/共56页第26页/共56页第27页/共56

8、页第28页/共56页30（two-dimensional gel electrophoresis,2-DE）双向凝胶电泳双向凝胶电泳第29页/共56页31聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction(polymerase chain reaction，PCR)PCR)第30页/共56页32第31页/共56页33第32页/共56页34第33页/共56页35第34页/共56页36InitialDNA8421Number of DNA molecules第35页/共56页37第36页/共56页38第37页/共56页39第38页/共56页40第39页/共56页41第40

9、页/共56页42引物设计引物设计第41页/共56页43PCR results M 1 2 3 4 5M, DNA Marker1,2,3,4,5: different annealing temperature400bp第42页/共56页445.5.定量定量PCR- Real Time PCRPCR- Real Time PCR 半定量半定量PCRPCR第43页/共56页45第44页/共56页46荧光定量荧光定量PCRPCR在在PCRPCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个累实时监测整个PCRPCR进程中每一轮循环产物的累积进程中每一轮循

10、环产物的累积数量，最后通过标准曲线对数量，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。未知模板进行定量分析的方法。提供提供 PCR PCR 扩增的瞬时信息扩增的瞬时信息第45页/共56页47 Real-Time PCR 所用的荧光化学分为两种：所用的荧光化学分为两种： 1.1.荧光染料：荧光染料：SYBR-Green SYBR-Green 2. 2.荧光探针：荧光探针：TaqManTaqMan第46页/共56页481 1、在、在PCRPCR反应体系中，加入过量反应体系中，加入过量SYBRSYBR荧光染料荧光染料，特异性掺入，特异性掺入DNADNA双链发射荧光信号，而游离的染料分子无荧光信号，

11、保证荧光信号的增加与双链发射荧光信号，而游离的染料分子无荧光信号，保证荧光信号的增加与PCRPCR产物的增加完全同步。产物的增加完全同步。第47页/共56页492 2、 PCRPCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针序列与正向，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针序列与正向/ /反向引物之间的基因序列互补。反向引物之间的基因序列互补。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬

12、灭基团吸收。 R = ReporterR = Reporter，Q = QuencherQ = Quencher第48页/共56页50PCRPCR扩增时，扩增时，TaqTaq酶的酶的5 53 3外切酶活性将探针酶切降解，外切酶活性将探针酶切降解，第49页/共56页51使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。每扩增一条每扩增一条DNADNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCRPCR产物形成完全同步。产物形成完全同步。 第50页/共56页52第51页/共56页53 Real time-PCR 反应体系：反应体系：cDNA 模板 2 l SYBR Premix Ex Taq （2） 12.5 l Forward primer1/ Act-F（10mM） 1 l Reverse primer2/ Act-R（10mM） 1 l ROX Reference Dye（50）